灰樹花(Grifola frondosa)的誘變及新菌株液態(tài)發(fā)酵不加或加硒米糠麩皮全料的研究.pdf

1、中國(guó)是一個(gè)盛產(chǎn)水稻和小麥的農(nóng)業(yè)大國(guó)，每年加工稻米和小麥面粉副產(chǎn)米糠超過(guò)1000萬(wàn)噸、麩皮超過(guò)3000萬(wàn)噸。尋求新的高效高值化深加工米糠和麩皮的新技術(shù)，對(duì)提升中國(guó)農(nóng)業(yè)及相關(guān)企業(yè)的競(jìng)爭(zhēng)力具有重要意義。灰樹花是一種藥食兩用真菌，富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有多種生理活性功能，如增強(qiáng)免疫力、輔助抗腫瘤治療、護(hù)肝等?；覙浠ǖ母鞣N酶可降解米糠和麩皮。液態(tài)發(fā)酵是一種快速、可工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)。為高效高值化轉(zhuǎn)化利用米糠和麩皮，本文的研究主題是利用灰樹花誘變新

2、菌株液態(tài)發(fā)酵不加或加硒米糠和麩皮全料獲得所需產(chǎn)物，如灰樹花菌絲體、菌絲多糖、富硒菌絲和富硒多糖等產(chǎn)物，涉及菌株誘變、發(fā)酵工藝、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)、富硒發(fā)酵工藝、富硒發(fā)酵動(dòng)力學(xué)等新問(wèn)題，具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下所述。
　　(1)針對(duì)已有灰樹花菌株Grifolafrondosa CCTCC M2011113，進(jìn)行紫外或微波誘變改良，以求獲得能更好降解米糠和麩皮的灰樹花新菌株。分別經(jīng)過(guò)連續(xù)10批誘變處理和培養(yǎng)皿培養(yǎng)初篩、復(fù)篩及搖瓶發(fā)酵篩選，得到紫

3、外誘變新菌株Grifola frondosa JSULIU-D1和微波誘變新菌株Grifola frondosa JSULIU-D2各一株。在100mL米糠和麩皮培養(yǎng)基中液體發(fā)酵，Grifola frondosa JSULIU-D1和Grifola frondosaJSULIU-D2的菌絲原料混合物干重分別為1.7g和1.6g，菌絲混合物多糖分別為110mg和135mg，兩新菌株生長(zhǎng)速度快，達(dá)到1.02mm/h，菌絲混合多糖較Grifo

4、lafrondosa CCTCC M2011113分別提高20％和50％，但紫外誘變新菌株發(fā)酵原料較徹底，相對(duì)較優(yōu)。
　　(2)對(duì)Grifola frondosa JSULIU-D1的發(fā)酵工藝進(jìn)行了研究，包括10個(gè)單因素影響試驗(yàn)，培養(yǎng)基均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)，10L、50L和500L罐放大試驗(yàn)。
　　單因素及水平范圍為轉(zhuǎn)速60～210r/min、溫度16～36℃、米糠濃度20～100g/L、麩皮濃度20～100g/L、磷酸二氫鉀濃度0

5、～3.6g/L、七水硫酸鎂濃度0～3.6 g/L、接種量4～20％、發(fā)酵醪pH3～11、250mL錐形瓶裝50～200mL、發(fā)酵時(shí)間2～12 d。6個(gè)研究指標(biāo)為分離出的菌絲干重、殘?jiān)芍?、干物質(zhì)失重、菌絲多糖重量、胞外糖重量和酵后總糖重量。測(cè)出了60條指標(biāo)變化曲線，并對(duì)各因素對(duì)發(fā)酵的影響規(guī)律進(jìn)行了分析，為發(fā)酵工藝的選擇提供了試驗(yàn)和理論依據(jù)。
　　采用U15(54)設(shè)計(jì)表，對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行初步的均勻設(shè)計(jì)U15(54)試驗(yàn)研究，米糠濃度1

6、0～50g/L、麩皮濃度10～30g/L、磷酸二氫鉀濃度0～3.6g/L、七水硫酸鎂濃度0～1.6g/L，試驗(yàn)指標(biāo)為殘留原料的菌絲原料混合物干重、干物質(zhì)失重、菌絲原料混合多糖重量、胞外糖量重、總糖重量，得到5個(gè)指標(biāo)的模型方程，并由此分析出本研究階段所得的優(yōu)化培養(yǎng)基組成為:米糠50g/L、麩皮30g/L、七水硫酸鎂0.8g/L。其它較為合理的工藝條件為:裝樣體積分率40％， pH自然，接種量10％，轉(zhuǎn)速150r/min，溫度28℃，發(fā)酵時(shí)

7、間9d。發(fā)酵結(jié)果為:菌絲原料混合干重濃度30.9 g/L，干物質(zhì)失重濃度25.5g/L，菌絲原料混合多糖濃度0.9g/L，胞外多糖濃度2.91g/L，總多糖濃度3.81 g/L。
　　實(shí)現(xiàn)10L、50L和500L發(fā)酵罐的放大試驗(yàn)，得到各次試驗(yàn)的投料和產(chǎn)物的概要表。500L罐的放大試驗(yàn)采用的培養(yǎng)基組成為米糠74.34g/L、麩皮9.66g/L、磷酸二氫鉀3.6g/L、七水硫酸鎂濃度3.6g/L，以1m3原始發(fā)酵醪為基準(zhǔn)，獲得17.0

8、kg絕干菌絲混合物，11.0kg胞外物質(zhì)。
　　(3)采用U24(245)設(shè)計(jì)表，對(duì)100mL初始培養(yǎng)基中的米糠重量、麩皮重量、磷酸二氫鉀重量、七水硫酸鎂重量及時(shí)間5個(gè)因素和對(duì)應(yīng)的水平進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以純菌絲干重為指標(biāo)，求得Grifola frondosa JSULIU-D1液態(tài)發(fā)酵米糠和麩皮全料經(jīng)驗(yàn)動(dòng)力學(xué)模型方程。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ头匠糖蟮帽狙芯侩A段的菌絲干重濃度為指標(biāo)的最優(yōu)發(fā)酵工藝為:培養(yǎng)基組成為米糠48.0 g/L、麩皮34.4

9、g/L、磷酸二氫鉀3.6 g/L、七水硫酸鎂1.8g/L，接種量10mL，100mL發(fā)酵醪裝樣于250mL錐形瓶，發(fā)酵溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，發(fā)酵時(shí)間為5.44d，菌絲干重濃度為23.47±1.32g/L。
　　(4)采用U20(204)設(shè)計(jì)表，根據(jù)(3)的菌絲生長(zhǎng)經(jīng)驗(yàn)動(dòng)力學(xué)模型方程，預(yù)測(cè)了100mL初始培養(yǎng)基組成的均勻設(shè)計(jì)20組試驗(yàn)的不同時(shí)間的菌絲生長(zhǎng)重量，并據(jù)此求出了理論動(dòng)力學(xué)Logistic型模型方程及模型參數(shù)

10、μm和Cmax與米糠重量、麩皮重量、磷酸二氫鉀重量、七水硫酸鎂重量的回歸關(guān)系式。
　　(5)采用U24(245)設(shè)計(jì)表，對(duì)100mL初始培養(yǎng)基的米糠重量（1L醪的麩皮濃度對(duì)應(yīng)為86.25-米糠濃度）、加硒重量、磷酸二氫鉀重量、七水硫酸鎂重量及時(shí)間5個(gè)因素和對(duì)應(yīng)的水平進(jìn)行了均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)，分別測(cè)出了分離出的菌絲干重、殘?jiān)芍?、干物質(zhì)失重、菌絲多糖重量、胞外多糖重量、總多糖重量、菌絲硒重、單位菌絲重的硒重及硒的轉(zhuǎn)化率等9個(gè)指標(biāo)對(duì)應(yīng)的數(shù)值

11、，并分別以菌絲干重、菌絲多糖重量、胞外多糖重量、菌絲硒重為指標(biāo)，求取得到Grifolafrondosa JSULIU-D1液態(tài)發(fā)酵加硒米糠和麩皮全料的相應(yīng)的經(jīng)驗(yàn)動(dòng)力學(xué)模型方程，根據(jù)以上方程求解的結(jié)果，推薦的較優(yōu)工藝是:米糠86.25g/L（可用低于25％的麩皮替代部分米糠）、麩皮0g/L、硒0.319mg/L、鉀鹽0.15g/L、鎂鹽0.15g/L，時(shí)間9d，所得菌絲干重濃度為35.44 g/L，菌絲多糖可達(dá)1.931g/L，菌絲硒濃度

12、為1.546mg/L，胞外多糖為2.43g/L。其它工藝條件為250 mL錐形燒瓶裝樣100 mL，接種量為10mL，發(fā)酵溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)速150r/min。
　　(6) Grifola frondosa JSULIU-D1液態(tài)發(fā)酵加硒米糠和麩皮全料時(shí)，并且在250 mL錐形燒瓶中接種10mL，裝樣100 mL，發(fā)酵溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)速150r/min不變，四個(gè)主要指標(biāo)的最高濃度和條件分別為:菌絲干重濃度最高可達(dá)42.48 g/

13、L，其中菌絲硒為1.54mg/L，對(duì)應(yīng)于米糠86.25 g/L、麩皮0g/L、硒0.319mg/L、磷酸二氫鉀3.6g/L、七水硫酸鎂3.6g/L，時(shí)間為8.93d;菌絲多糖濃度最高可達(dá)2.655g/L，對(duì)應(yīng)于米糠86.25 g/L、麩皮0g/L、硒5.182mg/L、磷酸二氫鉀0.15g/L、七水硫酸鎂0.15g/L，時(shí)間為6.11d;胞外多糖最高可達(dá)9.231 g/L，對(duì)應(yīng)于米糠0g/L、麩皮86.25 g/L、硒7.65mg/L、

14、磷酸二氫鉀0.15g/L、七水硫酸鎂3.6g/L，時(shí)間為12d;菌絲硒濃度最高可達(dá)3.995mg/L，對(duì)應(yīng)于米糠86.25g/L、麩皮0g/L、硒7.65mg/L、磷酸二氫鉀0.15g/L、七水硫酸鎂0.15g/L，時(shí)間為12d。
　　(7)采用U20(204)設(shè)計(jì)表，根據(jù)(5)的富硒時(shí)的菌絲生長(zhǎng)經(jīng)驗(yàn)動(dòng)力學(xué)模型方程，預(yù)測(cè)了100mL初始培養(yǎng)基的成分均勻設(shè)計(jì)20組試驗(yàn)不同時(shí)間的菌絲生長(zhǎng)重量，并據(jù)此求出富硒時(shí)的菌絲干重的理論動(dòng)力學(xué)Lo

15、gistic型模型方程及其模型參數(shù)μm和Cmax與米糠重量（包括麩皮重量）、加硒重量、磷酸二氫鉀重量、七水硫酸鎂重量的回歸關(guān)系式。
　　(8)采用納米粉碎技術(shù)對(duì)凍干菌絲進(jìn)行粉碎，用掃描電子顯微鏡(SEM)分析表征證明可以達(dá)到100％的破壁效果，為直接使用菌粉提供了依據(jù);對(duì)菌絲中的硒及重金屬Pb、Hg、 Cd采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)進(jìn)行了分析，所測(cè)重金屬殘留基本合格，開發(fā)產(chǎn)品應(yīng)注意控制原料;對(duì)產(chǎn)物的游離氨基酸采用氨