新型凝集載體的研制及其在食品安全快速檢測中的初步應用.pdf

1、食品安全歷來是人們關注的的焦點問題，而食源性致病菌引起的公共衛(wèi)生安全問題是食品安全最大的隱患之一。對食源性致病菌的檢測技術主要分為傳統(tǒng)檢測技術和現(xiàn)代快速檢測技術，現(xiàn)代快速檢測技術因具有快速、簡便、成本低、準確性高等優(yōu)點而備受關注。間接凝集試驗作為現(xiàn)代快速檢測技術的一種，能夠快速簡便的實現(xiàn)對致病菌的快速檢測，因而被廣泛應用于細菌學診斷。具有操作簡便、凝集現(xiàn)象直觀、致敏顆粒易保存、快速、無須借助高端儀器輔助檢測，檢測條件要求低等優(yōu)點而深受各

2、種檢測機構的親睞。載體是間接凝集試驗所必需的，也是凝集效果的關鍵影響因素。目前用于間接凝集試驗的主要有動物或人的紅細胞制備而成的紅細胞載體顆粒、活性炭粒載體、聚苯乙烯膠乳顆粒載體和明膠顆粒載體等。紅細胞作為載體顆粒，其大小均一，主要有綿羊、雞及家兔的紅細胞或O型人紅細胞。吸附的抗原類型主要是多糖類抗原，而蛋白質抗原或抗體的吸附能力相對較差。紅細胞致敏后出現(xiàn)易溶血、變脆、污染等問題，對使用時間要求嚴格，通常必須在2-3天內使用，紅細胞的穩(wěn)

3、定性較差，保存時間短。聚苯乙烯膠乳是一種人工合成的載體，粒徑約為0.8um的球形顆粒，均一性好，表面帶有負電荷，主要通過物理吸附的方式結合蛋白質，但這種吸附結合方式牢固性較差，抗體或抗原易于從聚苯乙烯膠乳上脫落，自身的物理化學性質也較為脆弱，容易受到各種理化因素的影響而出現(xiàn)自凝現(xiàn)象，最終導致凝集結果的誤判。而且這兩種常用的載體顏色單一，凝集顯現(xiàn)出來的凝集塊顏色也單一，依賴于自身所具有的顏色限制，在凝集過程中不能最大程度的放大反應信號，因

4、此，選擇一種性能優(yōu)異，穩(wěn)定性好，易于染料修飾、能夠滿足各種需求的載體就顯得尤為重要。二氧化硅微球(Silica Microspheres，SMSs)因其尺寸易于控制，穩(wěn)定性強，生物相容性好，不易發(fā)生溶脹及保存期長等獨特優(yōu)勢而引起科研工作者的極大重視。二氧化硅微球本身無色，用于間接凝集試驗并不能有效的放大反應信號。為了克服這個缺點，對微球表面進行修飾，由于二氧化硅微球表面含有大量羥基或不飽和殘鍵，易于功能化，使得存在進行表面染料修飾的可能

5、，這樣。獲得的微球在不影響自身性質的同時又具有鮮艷的色澤，能夠最大程度的放大凝集信號，使凝集現(xiàn)象更加明顯、直觀。有機活性染料，分子中含有化學性活潑的基團，在水溶液中可以通過共價結合的方式與棉、毛等纖維等反應形成共價復合物?；钚匀玖戏肿釉诮Y構上可以分為染料母體和活性基團兩個主要部分，活性染料的發(fā)色結構是染料母體，賦予染料不同色澤?；钚曰鶊F是染料分子與纖維直接其反應的基團，不同活性基團可以以不同方式與羥基進行反應。因此，從化學的角度來看，活

6、性染料如此多的種類和良好的化學反應活性使得它非常適合對二氧化硅微球進行染色。因此，將有機活性染料以穩(wěn)定的共價鍵修飾到微球表面，使微球著上鮮艷明亮的色澤，將能更有助于反應信號的放大和獲得更加明顯的反應現(xiàn)象。
　　綜上所示，本研究將嘗試通過反相微乳法合成納米級SiNps和半連續(xù)Stober法合成微米級SMSs，通過化學修飾的方式對微球表面進行染料修飾，以硅烷偶聯(lián)劑為媒介通過共價鍵結合到微球表面，制備得Colored-SiNps和Col

7、ored-SMSs。再將制備得的彩色微球通過生物偶聯(lián)技術修飾上抗體，使具備免疫活性。并以彩色二氧化硅微球為載體構建新型凝集技術用于食品中致病微生物的快速檢測，活性染料賦予了微球鮮艷的色彩，放大了凝集信號，使凝集現(xiàn)象更加醒目、直觀。本論文將主要從以下幾個方面探究了該新型凝集技術對致病菌和病毒的凝集性能，并優(yōu)化了凝集條件。
　　1基于Colored-SiNps微載體的新型凝集技術的凝集性能探究
　　為探究一種性能優(yōu)良的間接凝集試

8、驗載體，本研究將嘗試通過反相微乳法合成SiNPs，對SiNps表面進行活性大紅3G染料修飾，并優(yōu)化了染料的偶聯(lián)條件，制備得Red-SiNps，SEM表征Red-SiNps的形貌和粒徑。Nano2S激光粒度電位儀表征抗體修飾前后Red-SiNps的粒徑和電位變化，最后以此建立基于IgG-red-SiNps為載體的新型凝集技術，分別修飾上三種不同抗體與對應菌或病毒分別在U型反應板、V型反應板和凹圓載玻片凝集，用數(shù)碼相機對凝集結果進行表征。結

9、果表明:Red-SiNps粒徑均一規(guī)則，粒徑分布范圍窄，性能穩(wěn)定，單分散性好，顆粒顏色豐富，色澤選擇范圍廣。該研究不僅說明基于Colored-SiNps為載體的新型凝集技術在U型反應板、V型反應板和凹圓載玻片上的凝集性能優(yōu)異，特異性強，快速，準確度高。而且也說明了基于IgG-red-SiNps為載體的新型凝集技術在這些反應器中既對細菌如雞白痢雞傷寒沙門氏菌和阪崎腸桿菌的凝集性能優(yōu)異，對病毒如EDSV也有非常好的凝集性能。
　　2基

10、于Colored-SiNps微載體同時快速檢測兩種致病菌的新型凝集技術
　　基于Colored-SiNps為載體的新型凝集技術對于單種菌的凝集已經(jīng)顯示出了優(yōu)異的凝集性能和巨大優(yōu)勢，那么利用染料和SiO2易修飾的優(yōu)點探究該新型凝集技術對兩種致病菌的同時凝集就顯得尤為必要，因此，本研究旨在以阪崎腸桿菌和雞白痢雞傷寒沙門氏菌為凝集對象，探究一種同時與阪崎腸桿菌和雞白痢雞傷寒沙門氏菌混合液發(fā)生凝集反應且呈現(xiàn)出兩種不同顏色凝集現(xiàn)象的新型凝集

11、技術。結果表明:基于IgG-red-SiNps和IgG-blue-SiNps為載體的新型凝集技術在對不同濃度雞白痢雞傷寒沙門氏菌和等量生理鹽水的混合溶液凝集過程中，IgG-blue-SiNps只與對應的雞白痢雞傷寒沙門菌發(fā)生特異性凝集，出現(xiàn)了藍色凝集塊，且凝集現(xiàn)象隨著雞白痢雞傷寒沙門氏菌濃度的降低而有所減弱。修飾有板崎腸桿菌抗體的IgG-red-SiNps因沒有對應菌與之凝集而均勻分散在液滴中，無紅色凝集塊出現(xiàn)。在與不同濃度阪崎腸桿菌和

12、生理鹽水的混合液凝集中，也出現(xiàn)上述相同結果。而該新型凝集技術在與一種菌濃度固定另一種菌濃度變化的混合菌液混合后凝集，會同時出現(xiàn)兩種分別為紅色和藍色的凝集塊，其中，菌液濃度固定的凝集塊大小不變，而濃度變化的菌液的凝集現(xiàn)象則隨著濃度的稀釋而逐漸減弱。在兩種菌的同時凝集過程中，凝集時間僅需20-30s，準確性好，特異性好，可靠性強，過程簡便，凝集結果明顯、肉眼可觀，并且無交叉反應。因此，基于SiNps為載體對兩種致病菌的同時凝集技術具有靈敏、

13、經(jīng)濟、穩(wěn)定、簡便、快速、準確等優(yōu)點。
　　3基于Yellow-SiNps微載體快速檢測EDSV的新型凝集技術
　　本論文中已實現(xiàn)對單種致病菌和兩種致病菌的同時凝集，為了拓展基于SiNps載體新型凝集技術在病毒領域的檢測應用，擬探究一種新型凝集技術檢測雞減蛋綜合征病毒(Egg drop syndromeviruses，EDSV)。本研究以Yellow-SiNps為間接凝集試驗的載體，表面修飾EDS-76病毒的抗體，構建了一種基

14、于免疫活性二氧化硅納米顆粒(Immuneyellow silica nanoparticles，IgG-yellow-SiNps)微載體的快速檢測EDSV的新型凝集技術。結果表明，該新型凝集技術過程簡便，凝集現(xiàn)象明顯、肉眼可觀，特異性好，無交叉反應。對目標菌溶液的檢測限是103～109cfu·mL-1，載體Yellow-SiNps對凝集結果無干擾、并能放大凝集反應信號，說明基于yellow-SiNps為載體的新型凝集技術在檢測病毒方面也

15、具有靈敏、穩(wěn)定、簡便、快速、準確、經(jīng)濟、等優(yōu)點，適用于病毒的凝集檢測，并且凝集性能優(yōu)異。
　　4單分散微米級二氧化硅微球的制備研究
　　通過對納米級二氧化硅微粒新型凝集技術的研究表明基于納米級二氧化硅微粒為載體構建的新型凝集技術在檢測單種菌和病毒或同時檢測兩種菌都具有良好的凝集性能，在此基礎上，擬通過增大SiO2微粒的粒徑再次實現(xiàn)凝集信號的放大，并探究微米級SiO2微球(Micrometer-Sized Silica Mic

16、rospheres)對食源性致病菌的凝集性能。因此，本試驗通過半連續(xù)Stober法制備微米級SiO2微球(Silicamicrospheres，SMSs)，并用活性大紅3G對微球表明進行了修飾，探究了微米級SMSs的合成和染色機理。結果表明:通過半連續(xù)Stober法合成的微米級SMSs粒徑均一、形狀規(guī)則，具有鮮艷的色澤，粒徑分布范圍窄。
　　5基于Red-SMSs微載體快速檢測阪崎腸桿菌的新型凝集技術
　　通過半連續(xù)Stob

17、er法合成了微米級SMSs，擬以此建立一種基于微米級二氧化硅微球為載體快速檢測食源性致病菌的新型間接凝集技術，探究該新型凝集技術對阪崎腸桿菌的凝集性能。結果表明:基于Red-SMSs為載體的新型凝集技術，特異性好，無交叉反應;Red-SMSs的色澤鮮艷，使其凝集結果更加醒目，易于判斷;在4℃條件下能保藏近30天，穩(wěn)定性強，生物相容性好;對目標菌的檢測限為103cfu·mL-1-109 cfu·mL-1?；谖⒚准壎趸铻檩d體構建的新型