新型熒光實時定量檢測新城疫病毒方法的建立及其在雞肉食品安全控制中的應(yīng)用.pdf

1、新城疫是由新城疫病毒引起、侵害對象主要為雞和火雞的一種急性、熱性、敗血性、接觸性傳染病。因新城疫的普遍存在性，以及四季均可發(fā)生的流行性，現(xiàn)已成為危害世界禽類養(yǎng)殖最嚴(yán)重的疾病之一。因此，對新城疫進(jìn)行流行病學(xué)檢測，以及對其疑似病例做出快速而準(zhǔn)確的診斷，進(jìn)而掌控新城疫的遺傳變異規(guī)律，對于保護(hù)消費(fèi)者的生命安全，發(fā)展禽類養(yǎng)殖業(yè)以及減少經(jīng)濟(jì)損失具有非常重要意義。
　　新城疫病毒傳統(tǒng)的確診方法主要依賴病毒的分離鑒定及血清學(xué)檢測（主要包括雞胚中和

2、試驗、瓊脂擴(kuò)散試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗等方法），這些方法通常耗時長、靈敏度低且經(jīng)驗依賴性強(qiáng)。
　　在中國，根據(jù)新城疫診斷的國家標(biāo)準(zhǔn)要求，新城疫病毒的主要檢測方有:臨床診斷、血凝試驗、血凝抑制試驗、致病指數(shù)測定、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）五種檢測方法。但其中臨床診斷法受疑似感染病例的不同而存在較大個體差異，同時檢測人員的診斷經(jīng)驗與觀察習(xí)慣都對診斷結(jié)果有很大影響。因此臨床診斷只能作為新城疫病毒疑似病例的初步判斷。而血凝、血凝抑

3、制和致病指數(shù)測定都存在實驗操作復(fù)雜、實驗周期長、假陽性率較高的缺點。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測方法是一種快速準(zhǔn)確的檢測方法，但產(chǎn)物需經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和EB染色等，易產(chǎn)生污染和假陽性。在禽類養(yǎng)殖的迅速發(fā)展的當(dāng)下，需要建立一種快速、準(zhǔn)確、高效的檢測方法，以及時發(fā)現(xiàn)和控制保護(hù)消費(fèi)者食用安全，減少經(jīng)濟(jì)損失。
　　本研究所建立針對于新城疫病毒的Taq man一步法QRT-PCR檢測方法是在傳統(tǒng)RT-PCR檢測方法的基礎(chǔ)上添加T

4、aq man熒光探針，通過利用熒光定量PCR儀對熒光信號的收集來實現(xiàn)對PCR的全程實時檢測，最終結(jié)果通過制定標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知濃度的模板實行定量解析。通過本研究證明該方法相較于傳統(tǒng)方法而言具有更高的靈敏度，特異性和更強(qiáng)的穩(wěn)定性。本研究還將建立及優(yōu)化后的檢測方法應(yīng)用于臨床樣品檢測。經(jīng)過與傳統(tǒng)方法的對比檢測結(jié)果，證明該方法可以用于臨床樣品的檢測。
　　本研究分為兩個部分進(jìn)行研究:
　　新城疫病毒一步法QRT-PCR檢測條件優(yōu)化。將新

5、城疫病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品通過SPF雞胚培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)并提取，在檢測其純度與完整性合格后用作檢測模板。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，設(shè)計一對新城疫病毒的特異性引物與探針，在基礎(chǔ)反應(yīng)體系的上，通過篩選確定四項優(yōu)化因素:逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、Mg2+、Taq酶，利用正交試驗確定每種因素的最優(yōu)反應(yīng)條件及個因素之間交互作用，并建立針對新城疫病毒檢測的一步法qRT-PCR檢測條件。
　　新城疫病毒新型熒光實時定量檢測試劑的組裝及研制。在第一部分檢測方法及各項條件優(yōu)

6、化的基礎(chǔ)上，研制了一種城疫病毒新型熒光QRT-PCR檢測試劑盒，對組裝的試劑盒進(jìn)行了各項指標(biāo)如特異性、穩(wěn)定性、靈敏度、重復(fù)性、保存期等的驗證性試驗，獲得了豐富的試驗數(shù)據(jù)。此外，將符合質(zhì)量要求的試劑盒應(yīng)用于實驗室的臨床樣品檢測，獲得了重要的臨床應(yīng)用數(shù)據(jù)。這些研究數(shù)據(jù)都充分證明了本研究所組裝的新城疫病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑盒具有快速簡便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測性能穩(wěn)定等優(yōu)點，在我國新城疫病毒的檢測與檢測中具有巨大的應(yīng)用價值，可推廣