纖維素酶補(bǔ)料發(fā)酵工藝及木糖渣生產(chǎn)葡萄糖酸鈉的研究.pdf

1、當(dāng)前石油、煤炭等化石日趨枯竭，能源短缺、環(huán)境惡化等問題日益嚴(yán)峻，急需開發(fā)化石資源的替代品。可持續(xù)再生的木質(zhì)纖維素資源儲量豐富，并且未得到充分的開發(fā)利用，有些還造成環(huán)境污染。利用微生物生產(chǎn)纖維素酶，進(jìn)而將可持續(xù)再生的生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為液體燃料和化學(xué)品，是解決資源、能源和環(huán)境問題的有效途徑。本論文對以木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)纖維素酶和葡萄糖酸鈉的工藝進(jìn)行了研究，優(yōu)化了現(xiàn)場生產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵策略，以及雙酶法催化纖維素水解液生產(chǎn)葡萄糖酸鈉的工藝，并以草酸

2、青霉為底盤構(gòu)建了能夠進(jìn)行葡萄糖酸鈉CBP生產(chǎn)的工程菌株，為未來木質(zhì)纖維素生產(chǎn)葡萄糖酸鈉實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化提供了一條完整的技術(shù)路線。本論文的主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.用反復(fù)分批補(bǔ)料發(fā)酵策略提高了草酸青霉RE-10纖維素酶容積生產(chǎn)效率
　　選擇廉價的天然原材料如麩皮，脫木素木糖渣和豆餅粉及少量無機(jī)鹽作為草酸青霉RE-10纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分，使用Plackett-Burman設(shè)計篩選發(fā)現(xiàn)麩皮和NaNO3對纖維素酶的生產(chǎn)有

3、顯著影響。經(jīng)過中心組合設(shè)計(Centralcomposite design)優(yōu)化后得到最佳培養(yǎng)基配方，并在7.5 L發(fā)酵罐上驗證，濾紙酶活(FPase)在120 h達(dá)到12.69 U/mL，較原始培養(yǎng)基配方提高1.76倍，CMCase，pNPCse，pNPGse活力同樣比原始培養(yǎng)基有顯著提高。
　　采用反復(fù)分批補(bǔ)料發(fā)酵策略減少了發(fā)酵過程中的輔助時間，最終濾紙酶活的容積生產(chǎn)效率從66.85 U/L/h（分批發(fā)酵）提高到158.38

4、U/L/h。SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)不同時間點的粗酶液之間沒有明顯的差別。用糖化脫木素木糖渣(DCCR)實驗比較了不同時間點粗酶液、分批發(fā)酵粗酶液的纖維素降解能力，發(fā)現(xiàn)釋放出的糖量和葡聚糖轉(zhuǎn)化率沒有明顯差異。反復(fù)分批補(bǔ)料發(fā)酵的策略大幅提高了濾紙酶活的容積生產(chǎn)效率，在絲狀真菌纖維素酶工業(yè)生產(chǎn)方面具有較大的應(yīng)用潛力。
　　2.亞銨黑液誘導(dǎo)草酸青霉分泌纖維素酶并可用于流加補(bǔ)料發(fā)酵工藝
　　對亞銨黑液成分進(jìn)行分析，其組分中至少含有9

5、0-120 g/L低聚合度的半纖維素寡糖、30-50 g/L葡聚糖和20-40 g/L的單糖，此外以NH4+計殘銨含量為8-10 g/L。研究了添加亞銨黑液對草酸青霉RE-10在搖瓶中發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的影響，發(fā)現(xiàn)添加適量亞銨黑液可以提高纖維素酶的產(chǎn)量。但過量添加亞銨黑液時，亞銨黑液含有的糠醛、SO2、揮發(fā)性有機(jī)酸等物質(zhì)會抑制草酸青霉的生長和產(chǎn)酶。
　　以1 mL/L/h的速度連續(xù)流加亞銨黑液補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶，在144 h發(fā)酵液中

6、濾紙酶活力達(dá)到16.12 U/mL，比分批發(fā)酵的最高酶活12.70 U/mL(120 h)提高了26.93％?？紤]到在發(fā)酵過程中纖維素酶在48 h才開始大量合成，采用變速流加亞銨黑液的策略補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶，在144 h濾紙酶活達(dá)到17.66U/mL，此時蛋白濃度、內(nèi)切纖維素酶、外切纖維素酶和β-糖苷酶活力分別為7.50mg/mL、40.39 U/mL、1.77 U/mL和2.31 U/mL。變速流加策略沒有出現(xiàn)前期過量流加亞銨黑液時

7、還原糖濃度一直較高的情況，說明該策略減輕了亞銨黑液所含的抑制物在發(fā)酵前期對草酸青霉生長的抑制。
　　測定分批發(fā)酵和變速流加亞銨黑液補(bǔ)料發(fā)酵所生產(chǎn)的纖維素酶的各項酶活力和蛋白濃度，發(fā)現(xiàn)濾紙酶比活力從1.74 U/mg提高到2.40 U/mg。比較不同發(fā)酵策略生產(chǎn)的纖維素酶粗酶液在水解10％的DCCR時的效果，發(fā)現(xiàn)按等濾紙酶活添加纖維素酶（15 FPU/g葡聚糖）進(jìn)行水解的效果差異不大;而按等蛋白添加纖維素酶進(jìn)行水解時，流加亞銨黑液補(bǔ)

8、料發(fā)酵所產(chǎn)的粗酶液優(yōu)于分批發(fā)酵粗酶液。利用基于LC-MS/MS平臺的非標(biāo)定量蛋白組學(xué)手段，定性和相對定量地分析了變速流加亞銨黑液補(bǔ)料發(fā)酵和分批發(fā)酵兩者分泌組中蛋白的種類和豐度，發(fā)現(xiàn)與分批發(fā)酵粗酶液相比，變速流加亞銨黑液補(bǔ)料發(fā)酵的粗酶液有21個蛋白豐度上調(diào)，這些蛋白大部分都與生物質(zhì)的降解有關(guān)，很好的解釋了比酶活提高的原因。
　　用里氏木霉SN1驗證了流加亞銨黑液補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶工藝，以與分批發(fā)酵相比，F(xiàn)Pase、CMCase、p

9、NPCase和pNPGase酶活分別提高了44.98％、39.83％、72.17％、59.21％，表明流加亞銨黑液同樣對里氏木霉具有誘導(dǎo)分泌纖維素酶的作用。
　　3.共固定化雙酶催化纖維素DCCR水解液生產(chǎn)葡萄糖酸鈉
　　前期工作發(fā)現(xiàn)，額外補(bǔ)加β-葡萄糖苷酶能夠提高纖維素糖化的效果。使用過表達(dá)β-葡萄糖苷酶的草酸青霉I1-13菌株，以變速流加亞銨黑液補(bǔ)料發(fā)酵的策略生產(chǎn)纖維素酶，經(jīng)過168 h發(fā)酵，F(xiàn)Pase、pNPGase分

10、別達(dá)到13.63 U/mL、110.73U/mL。對DCCR補(bǔ)料分批糖化工藝進(jìn)行了底物濃度、纖維素酶用量、補(bǔ)料策略等一系列優(yōu)化，確定最優(yōu)的水解工藝為初始底物濃度為15％，纖維素酶初始用量為26 FPU/g葡聚糖，分別在24 h，48 h和72 h補(bǔ)加3.33％的DCCR，補(bǔ)料同時按12 FPU/g葡聚糖補(bǔ)加與補(bǔ)料量相對應(yīng)的纖維素酶。在7.5 L攪拌式生物反應(yīng)器上驗證了上述工藝，經(jīng)過120 h水解后水解液葡萄糖濃度達(dá)到145.80 g/L

11、。
　　優(yōu)化了GOD-CAT共固定化酶顆粒制備工藝。在發(fā)酵罐中考察了反應(yīng)條件對使用GOD-CAT共固定化酶催化DCCR水解液生產(chǎn)葡萄糖酸鈉的影響，最佳反應(yīng)條件為GOD用量16 U/g葡萄糖，pH5.4，溫度36℃，攪拌轉(zhuǎn)速300 rpm，通風(fēng)量1.25 VVM，反應(yīng)48 h可以得到166.87 g/L的葡萄糖酸鈉，轉(zhuǎn)化率為98.24％。固定化酶反復(fù)使用6次以后仍然能夠保持60％以上的活力。
　　4.以草酸青霉為底盤構(gòu)建了葡萄

12、糖酸鈉CBP生產(chǎn)工程菌株
　　利用草酸青霉A11△表達(dá)宿主表達(dá)了黑曲霉來源的GOD和CAT，SDS-PAGE顯示目的蛋白得到了表達(dá)，對相應(yīng)酶活進(jìn)行了測定，結(jié)果表明黑曲霉來源的GOD和CAT可以在草酸青霉中正確表達(dá)。以草酸青霉114-2為出發(fā)菌株，以gpdA(p)為啟動子成功構(gòu)建了同時過表達(dá)GOD和CAT的葡萄糖酸鈉CBP生產(chǎn)工程菌株z19，搖瓶發(fā)酵實驗發(fā)現(xiàn)z19菌株的胞外纖維素酶活力與出發(fā)菌株114-2相比沒有明顯差別，但具有較高