生防煙管菌的分離鑒定、條件優(yōu)化及其作用機制研究.pdf

1、病原真菌是植物病害最主要的致病因子，并時常對農(nóng)作物生產(chǎn)造成毀滅性破壞，最終導致農(nóng)作物大量減產(chǎn)而嚴重影響經(jīng)濟效益。由于農(nóng)業(yè)防治的不足、抗病性品種的缺失以及化學農(nóng)藥防治所引起的環(huán)境污染和致病菌抗藥性等問題日益嚴重，具有經(jīng)濟、高效和環(huán)保等特點的生物防治成為目前植物病害防治的主要技術手段。然而，生防菌的抑菌能力、抗病范圍及對不同植物病害、地區(qū)施用環(huán)境的差異，會限制生物防治的應用效果。近年來，生防真菌由于種類多、范圍廣，易分離和開發(fā)應用，且環(huán)境適

2、應性強和抑菌范圍廣等特點在生防微生物中應用更為普遍，在防治植物真菌病害中也備受關注。因此，篩選具有廣譜、高效且穩(wěn)定抑菌效果的生防真菌是植物病害生物防治的一個新方向。
　　本研究采用平板對峙試驗和搖瓶培養(yǎng)抑菌試驗在紫色土壤中篩選獲得一株對西瓜蔓枯病菌（Didymella bryoniae）、油菜核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）、松立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）和柑橘炭疽病菌（Collet

3、otrichum gloeosprioides）均有良好拮抗效果的生防真菌，并進一步研究了其對不同病原真菌的抑菌效果、生理特性、最佳發(fā)酵條件及其生防作用機制，其結(jié)果如下：
　　1、菌株篩選結(jié)果顯示：分離菌株對松立枯絲核菌、西瓜蔓枯病菌、柑橘炭疽病菌和油菜核盤菌的抑菌率分別達到80.5％、59.6%、65.7%和69.9%；搖瓶培養(yǎng)抑菌試驗中的抑菌率則分別為43.4%、49.6%、57.3%和51.8%。根據(jù)菌株的培養(yǎng)特性、形態(tài)學特

4、征以及18S rRNA基因序列分析，將其鑒定為煙管菌（Bjerkandera adusta），命名為煙管菌 M-1。目前，國內(nèi)外尚無該菌株對上述4種病原真菌的生防作用報道，這也是利用該菌株進行植物真菌病害生物防治的又一補充。
　　2、菌株生長條件的研究結(jié)果表明：菌株M-1可以利用多種碳源和氮源進行生長，但不能利用尿素為氮源生長，其中最適碳源為麥芽糖，最適氮源為硝酸鉀。pH試驗表明，菌株M-1在酸性、中性和堿性環(huán)境中均能生長，但在不

5、同pH環(huán)境下生長情況各不相同，整體呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢，在初始pH為7.0時生長最好。此外，菌株M-1在15℃~36℃條件下均可生長，最適溫度為32℃，但在10℃和40℃時均不能生長。添加無機鹽MgSO4能夠促進菌株M-1生長，而ZnSO4和CuSO4卻能抑制其生長。
　　3、通過單因素試驗選擇生防菌株最適發(fā)酵條件，研究表明，碳源：對西瓜蔓枯病菌、油菜核盤菌和松立枯絲核菌抑菌率最高的碳源均為麥芽糖，而對柑橘炭疽病菌抑菌率最高時

6、的碳源為葡萄糖。菌株最適發(fā)酵氮源為硝酸銨，而 C/N為6.0:1~8.4:1時對4種病原真菌的抑制效果較好，其中最適C/N為7.2:1。發(fā)酵液最適碳源用量均為20g/L。pH：對西瓜蔓枯病菌、油菜核盤菌、松立枯絲核菌和柑橘炭疽病菌抑菌效果最好的pH分別為9.0、5.0、7.0和9.0。溫度：對西瓜蔓枯病菌和松立枯絲核菌抑菌率最高時的發(fā)酵溫度均為30℃，而對油菜核盤菌和柑橘炭疽病菌為25℃。裝液量：對松立枯絲核菌抑菌率的最佳裝瓶量為45%

7、（v/v），而對另外3種病原真菌的最佳裝瓶量為30%。轉(zhuǎn)速及時間：菌株M-1液體發(fā)酵的最適轉(zhuǎn)速為180r/min，最適發(fā)酵時間均為20d。菌株M-1發(fā)酵液在80℃水浴處理后抑菌率仍在19.3%以上，而100℃處理后抑菌率也在15%左右，其發(fā)酵液表現(xiàn)出一定的熱穩(wěn)定性，但是以40℃時效果最好。
　　4、采用響應曲面法對菌株M-1發(fā)酵條件進行優(yōu)化，得到了最優(yōu)條件組合。其中，對西瓜蔓枯病菌抑制作用最佳的發(fā)酵條件是：C/N為7.1，pH為7

8、.4，裝瓶量為44%，時間為19d，轉(zhuǎn)速為180r/min，溫度為29℃，抑菌率可由49.6%提升至52.6%；對油菜核盤菌抑制效果最好的發(fā)酵條件：C/N為7.5，pH為4.7，裝瓶量為33%，時間為22d，轉(zhuǎn)速為180r/min，溫度為32℃，優(yōu)化后其發(fā)酵液抑菌率可以由51.8%增加到80.9%；對柑橘炭疽病菌抑制效果最好的發(fā)酵條件：C/N為7.5， pH為6.5，裝瓶量為36%，時間為22d，轉(zhuǎn)速為180r/min，溫度為30℃，此

9、時的抑菌率能夠達到71.1%；對松立枯絲核菌抑制效果最好的發(fā)酵條件：C/N為10.0， pH為5.0，裝瓶量為58%，時間為30d，轉(zhuǎn)速為140r/min，溫度為35℃，此時的抑菌率可高達91.8%。優(yōu)化后發(fā)酵液的抑菌活性均有所提高，為該菌株的實踐生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。
　　5、生防菌株重寄生作用機制的研究顯示：在掃描電鏡下清晰地觀察到菌株M-1菌絲直接穿插、刺透油菜核盤菌菌絲，使后者菌絲膨大、變形甚至破裂，而且也可直接穿透西瓜蔓枯

10、病菌的菌絲。因此，煙管菌 M-1對油菜核盤菌和西瓜蔓枯病菌的重寄生作用是通過直接穿插、刺透和裂解病原真菌菌絲實現(xiàn)的，該機制也是生防菌重要的作用機制之一。
　　6、盆栽試驗結(jié)果表明：菌株M-1對西瓜蔓枯病菌和油菜核盤菌的病情指數(shù)分別為8.4和10.7，對黃瓜植株和油菜植株的防病效果分別達到74.3%和71.4%，均高于農(nóng)藥對照，表現(xiàn)出很好的防病效果。菌株 M-1對黃瓜植株和油菜植株抗病性相關酶活性的增加均有不同程度地促進作用，對其葉