黃曲霉生防菌的篩選鑒定及高效菌株JPP1的生防機制.pdf

1、環(huán)境中存在多種生物致癌因素,如黃曲霉在土壤中廣泛存在,在適宜條件下侵染寄生體產生毒素。黃曲霉毒素能引起人畜的急慢性中毒,且具有“三致”作用,甚至影響生態(tài)安全?；ㄉ谖覈侵匾挠土虾徒洕魑?但黃曲霉毒素含量超標非常嚴重。傳統(tǒng)的方法是利用農藥防治,但農藥的大量頻次使用將造成農業(yè)面源污染,對土壤、水體甚至大氣產生危害。對環(huán)境友好的生物防治技術是花生產前治理黃曲霉毒素污染的有效方法,而微生物農藥是生物防治的重要手段。
　　本研究利用不

2、同類型的培養(yǎng)基,從全國6個省份花生主產區(qū)的花生樣品果殼中分離獲得內生細菌236株。經過可視化平板培養(yǎng)篩選,其中72株對黃曲霉毒素產生有明顯抑制效果。采用tip-culture方法定量確定了其中24株對菌絲生長的拮抗率大于90％;54株對黃曲霉毒素產生的拮抗率大于90%。
　　以16SrDNA基因序列分析為基礎,結合形態(tài)學觀察和部分生理生化特性測定,將篩選出的72株內生菌進行系統(tǒng)發(fā)育學分析。結果表明,歸于芽孢桿菌科(Bacillac

3、eae)的絕大部分(48株)屬于芽孢桿菌屬(Bacillus),為具有生防作用的花生果殼內生菌的優(yōu)勢種群,分別聚類于7個種:解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens),枯草芽孢桿菌(B.subtilis),甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(B.methylotrophicus),短小芽孢桿菌(B.pumilus),特基拉芽孢桿菌(B.tequilensis),梭狀芽孢桿菌(B.fusiformis)和蠟樣芽孢桿菌(B.cereus);歸

4、于活動球菌科(Planococcaceae)的僅有一株BPM12-1,與LysinibacillusxylanilyticusCCUG57438T親緣關系最近。歸于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的18株分別屬于腸桿菌屬(Enterobacter)和沙雷氏菌屬(Serratia),其中腸桿菌屬(Enterobacter)的7株分別屬于阿氏腸桿菌(E.asburiae)、陰溝腸桿菌(E.cloacae)和E.ludwigi

5、i;沙雷氏菌屬(Serratia)的11株均為粘質沙雷氏菌(S.marcescens)。歸類于黃單胞菌科(Xanthomonadaceae)的3株屬于寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)的嗜麥芽窄食單胞菌(S.maltophilia)。歸類于假單胞菌科(Pseudomonadaceae)的2株屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)的地中海假單胞菌(P.mediterranea)。
　　采用透明圈法確定篩選出的72株內

6、生菌降解幾丁質的能力,其中22株有水解圈產生。采用DNS法測定其中各類群代表菌株的酶活,沙雷氏菌屬(Serratia)和寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)的代表菌株酶活相對較高。選擇其中一株酶活較高且生防作用顯著的細菌,綜合利用表型、生理生化特征、基因型和系統(tǒng)發(fā)育分析結果將該菌鑒定為粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens),菌株編號為JPP1。通過PCR擴增獲得長度為1789bp的核苷酸序列,含有一個完整的15

7、00bp的開放閱讀框,編碼499個氨基酸,經過相似性比對和系統(tǒng)進化分析,確定菌株JPP1所產幾丁質酶為ChiB。該酶分子量為55480.3Da、等電點5.93、較穩(wěn)定、屬脂溶蛋白、具有一定親水性。二級結構為31.66%的α螺旋,20.64%的延伸帶和47.70%的無規(guī)則卷曲。三級結構與一株野生型粘質沙雷氏菌所產幾丁質酶ChiB復合物的結構同源性為98.6%。
　　通過PB實驗設計和中心組合設計法確定粘質沙雷氏菌JPP1的產幾丁質酶

8、優(yōu)化培養(yǎng)基配方為:膠體幾丁質12.70g,葡萄糖7.34g,蛋白胨5.00g,硫酸銨1.32g,K2HPO40.7g,MgSO4·7H2O0.5g。通過中心組合設計法,確定發(fā)酵條件的裝液量、轉速、接種量分別為23.2ml、116rpm和4.3%時,所建立模型的最大響應值酶活為31.96U,搖瓶培養(yǎng)驗證實驗結果與之較為接近。
　　幾丁質酶的穩(wěn)定性試驗顯示該酶熱穩(wěn)定性較好;pH值5~8范圍內相對酶活在80%以上;Zn2+、Cu2+、F

9、e3+對酶活有明顯的抑制作用,Ca2+、Mn2+對酶活有一定的促進作用,Na+和K+對酶活的影響不大;保護劑EDTA、巰基乙醇和Tween80可以一定程度保護酶的活性,變性劑SDS則使得酶活有明顯降低。
　　掃描電鏡結果顯示菌株JPP1產生的幾丁質酶使得寄生曲霉菌絲的細胞壁被部分降解;采用tip-culture方法,確定酶液濃度與菌絲生長的抑制率和毒素產生的抑制率呈現出良好的線性關系;TLC實驗結果顯示經酶液處理后產毒寄生曲霉菌株

10、沒有明顯產生黃曲霉毒素。RT-PCR實驗表明經過該酶處理的曲霉菌株不存在aflR、aflC(pksL1)和aflO(dmtA)基因的轉錄。因此確定該菌株產生的幾丁質酶是其發(fā)揮生防作用的主要機制。
　　確定花生生物種衣劑的主要配方,配比為4:1的聚乙烯醇和羧甲基纖維素鈉為復合成膜劑,增塑劑為1%的甘油,與發(fā)酵菌液按照4:1的配比混合均勻后包衣,再用2%的CaCl2作為交聯劑處理。該配方對生防粘質沙雷氏菌JPP1的生長沒有抑制作用?；?/p>