黃曲霉生防菌的篩選鑒定及高效菌株JPP1的生防機制.pdf

1、環(huán)境中存在多種生物致癌因素,如黃曲霉在土壤中廣泛存在,在適宜條件下侵染寄生體產(chǎn)生毒素。黃曲霉毒素能引起人畜的急慢性中毒,且具有“三致”作用,甚至影響生態(tài)安全。花生在我國是重要的油料和經(jīng)濟作物,但黃曲霉毒素含量超標(biāo)非常嚴重。傳統(tǒng)的方法是利用農(nóng)藥防治,但農(nóng)藥的大量頻次使用將造成農(nóng)業(yè)面源污染,對土壤、水體甚至大氣產(chǎn)生危害。對環(huán)境友好的生物防治技術(shù)是花生產(chǎn)前治理黃曲霉毒素污染的有效方法,而微生物農(nóng)藥是生物防治的重要手段。
　　本研究利用不

2、同類型的培養(yǎng)基,從全國6個省份花生主產(chǎn)區(qū)的花生樣品果殼中分離獲得內(nèi)生細菌236株。經(jīng)過可視化平板培養(yǎng)篩選,其中72株對黃曲霉毒素產(chǎn)生有明顯抑制效果。采用tip-culture方法定量確定了其中24株對菌絲生長的拮抗率大于90％;54株對黃曲霉毒素產(chǎn)生的拮抗率大于90%。
　　以16SrDNA基因序列分析為基礎(chǔ),結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和部分生理生化特性測定,將篩選出的72株內(nèi)生菌進行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析。結(jié)果表明,歸于芽孢桿菌科(Bacillac

3、eae)的絕大部分(48株)屬于芽孢桿菌屬(Bacillus),為具有生防作用的花生果殼內(nèi)生菌的優(yōu)勢種群,分別聚類于7個種:解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens),枯草芽孢桿菌(B.subtilis),甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(B.methylotrophicus),短小芽孢桿菌(B.pumilus),特基拉芽孢桿菌(B.tequilensis),梭狀芽孢桿菌(B.fusiformis)和蠟樣芽孢桿菌(B.cereus);歸

4、于活動球菌科(Planococcaceae)的僅有一株BPM12-1,與LysinibacillusxylanilyticusCCUG57438T親緣關(guān)系最近。歸于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的18株分別屬于腸桿菌屬(Enterobacter)和沙雷氏菌屬(Serratia),其中腸桿菌屬(Enterobacter)的7株分別屬于阿氏腸桿菌(E.asburiae)、陰溝腸桿菌(E.cloacae)和E.ludwigi

5、i;沙雷氏菌屬(Serratia)的11株均為粘質(zhì)沙雷氏菌(S.marcescens)。歸類于黃單胞菌科(Xanthomonadaceae)的3株屬于寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)的嗜麥芽窄食單胞菌(S.maltophilia)。歸類于假單胞菌科(Pseudomonadaceae)的2株屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)的地中海假單胞菌(P.mediterranea)。
　　采用透明圈法確定篩選出的72株內(nèi)

6、生菌降解幾丁質(zhì)的能力,其中22株有水解圈產(chǎn)生。采用DNS法測定其中各類群代表菌株的酶活,沙雷氏菌屬(Serratia)和寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)的代表菌株酶活相對較高。選擇其中一株酶活較高且生防作用顯著的細菌,綜合利用表型、生理生化特征、基因型和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果將該菌鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens),菌株編號為JPP1。通過PCR擴增獲得長度為1789bp的核苷酸序列,含有一個完整的15

7、00bp的開放閱讀框,編碼499個氨基酸,經(jīng)過相似性比對和系統(tǒng)進化分析,確定菌株JPP1所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶為ChiB。該酶分子量為55480.3Da、等電點5.93、較穩(wěn)定、屬脂溶蛋白、具有一定親水性。二級結(jié)構(gòu)為31.66%的α螺旋,20.64%的延伸帶和47.70%的無規(guī)則卷曲。三級結(jié)構(gòu)與一株野生型粘質(zhì)沙雷氏菌所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶ChiB復(fù)合物的結(jié)構(gòu)同源性為98.6%。
　　通過PB實驗設(shè)計和中心組合設(shè)計法確定粘質(zhì)沙雷氏菌JPP1的產(chǎn)幾丁質(zhì)酶

8、優(yōu)化培養(yǎng)基配方為:膠體幾丁質(zhì)12.70g,葡萄糖7.34g,蛋白胨5.00g,硫酸銨1.32g,K2HPO40.7g,MgSO4·7H2O0.5g。通過中心組合設(shè)計法,確定發(fā)酵條件的裝液量、轉(zhuǎn)速、接種量分別為23.2ml、116rpm和4.3%時,所建立模型的最大響應(yīng)值酶活為31.96U,搖瓶培養(yǎng)驗證實驗結(jié)果與之較為接近。
　　幾丁質(zhì)酶的穩(wěn)定性試驗顯示該酶熱穩(wěn)定性較好;pH值5~8范圍內(nèi)相對酶活在80%以上;Zn2+、Cu2+、F

9、e3+對酶活有明顯的抑制作用,Ca2+、Mn2+對酶活有一定的促進作用,Na+和K+對酶活的影響不大;保護劑EDTA、巰基乙醇和Tween80可以一定程度保護酶的活性,變性劑SDS則使得酶活有明顯降低。
　　掃描電鏡結(jié)果顯示菌株JPP1產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶使得寄生曲霉菌絲的細胞壁被部分降解;采用tip-culture方法,確定酶液濃度與菌絲生長的抑制率和毒素產(chǎn)生的抑制率呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系;TLC實驗結(jié)果顯示經(jīng)酶液處理后產(chǎn)毒寄生曲霉菌株

10、沒有明顯產(chǎn)生黃曲霉毒素。RT-PCR實驗表明經(jīng)過該酶處理的曲霉菌株不存在aflR、aflC(pksL1)和aflO(dmtA)基因的轉(zhuǎn)錄。因此確定該菌株產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶是其發(fā)揮生防作用的主要機制。
　　確定花生生物種衣劑的主要配方,配比為4:1的聚乙烯醇和羧甲基纖維素鈉為復(fù)合成膜劑,增塑劑為1%的甘油,與發(fā)酵菌液按照4:1的配比混合均勻后包衣,再用2%的CaCl2作為交聯(lián)劑處理。該配方對生防粘質(zhì)沙雷氏菌JPP1的生長沒有抑制作用?；?/p>