雞蛋膽固醇營養(yǎng)效果及其脂質(zhì)調(diào)控成分篩選與機理研究.pdf

1、針對雞蛋膽固醇其營養(yǎng)作用目前仍有爭議的現(xiàn)狀，本文以雞蛋及其活性成分作為研究對象，開展了雞蛋膽固醇營養(yǎng)動物實驗、雞蛋調(diào)控膽固醇活性成分的篩選及雞蛋活性脂質(zhì)調(diào)控膽固醇吸收代謝的機理研究等系列工作。主要的研究內(nèi)容和主要研究成果摘要如下:
　　 本實驗以健康Sprague Dawley大鼠為動物模型，攝入同等膽固醇含量的化學膽固醇(CLG)、蛋黃(EYG)、全蛋(WEG)及不含膽固醇的普通飼料(CCG)進行飲食干預90 d，系統(tǒng)檢測膽固

2、醇及其代謝物在大鼠體內(nèi)各臟器、血液及糞便中的含量，通過肝臟切片觀察病變，運用RT-qPCR檢測膽固醇相關代謝酶的轉(zhuǎn)錄水平表達。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)EYG組與WEG組大鼠的身體狀況、血脂、肝脂等與CCG組相比無顯著差異，但與CLG組相比較，其肝臟TG、TC及LDL-膽固醇，肝臟TG與TC，肝臟損傷程度，肝臟羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMG-CoAR)與酰基輔酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(ACAT)的mRNA表達量都顯著性地降低;而肝臟HDL-膽固醇

3、與TBA，糞便中性固醇與TBA，肝臟低密度脂蛋白受體(LDLr)、膽固醇-7α羥化酶(CYP7A1)與卵磷脂-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)的mRNA表達量均顯著性地升高。實驗結(jié)果表明雞蛋對健康SD大鼠血脂無顯著性影響，雞蛋的攝入能顯著抑制膽固醇體內(nèi)從頭合成及以膽固醇酯的形式在體內(nèi)儲存，促進了膽固醇向膽汁酸的轉(zhuǎn)化，并隨糞便排出。
　　 建立了體外Caco-2細胞單層吸收模型，并從形態(tài)學、酶學、跨膜電阻及通透率對其進行評估。實驗結(jié)果

4、發(fā)現(xiàn)經(jīng)過21 d培養(yǎng)的Caco-2細胞可以作為小腸吸收的體外模型，倒置顯微鏡與電鏡檢查，發(fā)現(xiàn)細胞單層模型的A側(cè)分化形成微絨毛與細胞間形成了完整的緊密連接結(jié)構，細胞單層模型的跨膜電阻值均符合220Ω·cm2-600Ω.cm2的要求，細胞單層的標志性酶（堿性磷酸酶）活力增加表現(xiàn)出明顯的極化，熒光黃A-B側(cè)轉(zhuǎn)運的滲透系數(shù)低于轉(zhuǎn)運實驗規(guī)定的1.0×10-6 cm/s。上述結(jié)果表明建立的Caco-2細胞單層模型符合物質(zhì)轉(zhuǎn)運實驗的條件，可以作為膽固

5、醇吸收轉(zhuǎn)運研究的體外模型。以Caco-2細胞單層為模型，研究了一系列濃度的膽固醇在不同pH值下的雙向轉(zhuǎn)運情況，以及NPC1L1蛋白抑制劑依折麥布(Eetimibe)對膽固醇細胞轉(zhuǎn)運的影響。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膽固醇在Caco-2細胞單層模型中的轉(zhuǎn)運表現(xiàn)為一定的濃度與pH值依賴性和飽和性，在膽固醇添加濃度為100μmol/L供液pH值為7.4條件下，膽固醇在Caco-2細胞單層模型中的轉(zhuǎn)運滲透系數(shù)最高，其攝入比為4.73，膽固醇在Caco-2細

6、胞單層吸收過程中受到載體轉(zhuǎn)運蛋白的調(diào)節(jié)，而膽固醇外排是以被動擴散的方式轉(zhuǎn)運。當加入Ezetimibe(10μmol/L)之后膽固醇攝入比顯著降低。實驗結(jié)果說明膽固醇在Caco-2細胞單層模型中的轉(zhuǎn)運為載體蛋白NPC1L1介導的主動轉(zhuǎn)運。
　　 以Caco-2細胞單層為模型，提取雞蛋中脂質(zhì)、蛋白質(zhì)類組分，借助體外人工胃腸模擬消化系統(tǒng)，采用液體閃爍追蹤3-H-膽固醇，研究各組分對膽固醇在Caco-2細胞單層模型中攝取與轉(zhuǎn)運的影響。實

7、驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雞蛋中的蛋白質(zhì)（蛋清總蛋白質(zhì)、蛋黃總蛋白質(zhì)及卵黏蛋白）、磷脂（卵磷脂與神經(jīng)鞘磷脂）及n-3系列的多不飽和脂肪酸（EPA與DHA）能顯著地抑制Caco-2細胞中膽固醇的攝取與轉(zhuǎn)運，棕櫚酸與溶血卵磷脂能夠促進Caco-2細胞中膽固醇的攝取與轉(zhuǎn)運，而單不飽和脂肪酸與腦磷脂對Caco-2細胞中膽固醇的攝取與轉(zhuǎn)運無顯著性影響。上述結(jié)果表明雞蛋中含有調(diào)控膽固醇吸收轉(zhuǎn)運的成分，為進一步揭示其對膽固醇代謝網(wǎng)絡的調(diào)控及機制提供理論基礎。

8、>　　 考察雞蛋各磷脂成分對膽固醇微膠束化學組成、?；悄懰徕c結(jié)合能力、微膠束中膽固醇與?；悄懰猁}的溶解能力及微膠束分子量變化的影響。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蛋黃卵磷脂與神經(jīng)鞘磷脂的添加促進了膽固醇參與微膠束的形成，且隨著添加量的增加使得?；悄懰徕c的結(jié)合能力增強。當微膠束孵育24 h后，蛋黃卵磷脂與神經(jīng)鞘磷脂組的鹽溶液中膽固醇溶解度顯著地低于其他組，蛋黃神經(jīng)鞘磷脂組的?；悄懰徕c的溶解度顯著性降低。此外，微膠束的分子量隨著蛋黃卵磷脂與神經(jīng)鞘磷脂添加

9、濃度的增加而增加，表明微膠束釋放的速度受到了這兩種磷脂的約束，減慢了微膠束中膽固醇通過靜止水層向腸上皮細胞轉(zhuǎn)運前的釋放過程。以上結(jié)果表明雞蛋卵磷脂與神經(jīng)鞘磷脂通過改變膽固醇混合微膠束的物理化學性質(zhì)，在一定程度上抑制了微膠束向小腸上皮細胞的轉(zhuǎn)運過程。
　　 通過RT-qPCR與Westem-blot檢測不同濃度雞蛋卵磷脂與神經(jīng)鞘磷脂對Caco-2細胞膽固醇吸收通路中關鍵蛋白轉(zhuǎn)錄與翻譯水平表達的影響。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)雞蛋卵磷脂與神經(jīng)鞘磷

10、脂均能顯著性抑制小腸膽固醇吸收關鍵蛋白NPC1L1（尼曼-匹克C1型類似蛋白1）的轉(zhuǎn)錄與翻譯，從而抑制膽固醇在Caco-2細胞中的攝入與轉(zhuǎn)運。雞蛋卵磷脂與神經(jīng)鞘磷脂對于NPC11L基因與蛋白表達的抑制可能與轉(zhuǎn)錄因子SREBP（固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白）激活受到抑制相關。雞蛋卵磷脂通過促進膽固醇合成HDL的方式移除Caco-2細胞中多余的膽固醇。此外，高濃度的蛋黃神經(jīng)鞘磷脂有可能通過下調(diào)Caveolin1基因表達從而抑制膽固醇的吸收。

11、　　 通過RT-qPCR與Western-blot檢測雞蛋中六種脂肪酸(PA、OA、LA、AA、EPA、DHA)對Caco-2細胞膽固醇吸收通路中關鍵蛋白轉(zhuǎn)錄與翻譯水平表達的影響。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)EPA與DHA均能顯著性抑制小腸膽固醇吸收關鍵蛋白NPC1L1的轉(zhuǎn)錄與翻譯，從而抑制膽固醇在Caco-2細胞中的攝入與轉(zhuǎn)運，而高濃度的PA與OA通過促進NPC1L1基因的轉(zhuǎn)錄表達使得膽固醇在Caco-2細胞中的攝入與轉(zhuǎn)運增加，且NPCL1L基因的