藏花酸在Caco-2細胞模型中吸收機制的研究.pdf

1、背景：
　　藏花酸（crocetin）屬于類胡蘿卜素物質(zhì)，具有不飽和共軛多烯酸結構。藏花酸作為活血化瘀的中藥藏紅花的主要有效成分，研究表明其具有顯著的生物學效應，現(xiàn)已越來越受到學術界的廣泛關注。藏花酸不僅常運用于抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抗心律失常、抗高血壓等方面，還可以治療出血性休克作用，同時具有抗氧化和保肝利膽、降膽固醇等多重作用。藏花酸藥代動力學方面的研究比較局限，有關文獻表明藏花酸在口服給藥后可以通過胃腸道吸收，吸收速度較快

2、但生物利用度較低，并且其吸收機制尚未見報道。
　　口服藥物在胃腸道的吸收分為簡單擴散、易化擴散和主動轉(zhuǎn)運，后兩者是需要轉(zhuǎn)運體介導的，P-糖蛋白即為其中一種轉(zhuǎn)運體，其主要作用是阻止外源性物質(zhì)及對機體不利的代謝物經(jīng)腸道吸收，在藥物的吸收過程中有十分重要的意義。許多研究資料也已表明口服藥物的吸收受到P-糖蛋白外排作用的影響非常顯著，同為P-糖蛋白底物的藥物合用，會因其在P-糖蛋白水平的競爭或抑制，而導致藥物發(fā)生吸收轉(zhuǎn)運改變的報道屢見不鮮

3、。為避免口服藏花酸與其它藥物在體內(nèi)產(chǎn)生相互影響，展開藏花酸在胃腸道吸收轉(zhuǎn)運機制研究很有必要。Caco-2細胞模型是研究口服藥物吸收的體外細胞培養(yǎng)模型，用于研究藥物轉(zhuǎn)運的機制，包括吸收機制和排出機制，目前在口服藥物進入臨床應用前的的初篩和研究藥物在腸道中的吸收的過程有廣泛應用。因此，本課題利用Caco-2細胞模型研究藏花酸吸收轉(zhuǎn)運機制及該藥與P-糖蛋白的關聯(lián)，為闡明藏花酸與P-糖蛋白底物合用是否會產(chǎn)生藥代動力學方面的相互作用提供試驗依據(jù)。

4、
　　目的：
　　利用Caco-2單層細胞模型模擬小腸吸收，通過考察時間、藥物濃度以及P-糖蛋白專屬抑制劑維拉帕米對藏花酸攝取轉(zhuǎn)運的影響，揭示藏花酸與P-糖蛋白的關聯(lián)性，以探索藏花酸的吸收機制。
　　方法：
　　1．建立生物樣品中藏花酸的HPLC檢測方法；
　　2.建立Caco-2細胞模型，并驗證其完整性及緊密性；
　　3．分別考察時間、藥物濃度、P-糖蛋白抑制劑—維拉帕米對Caco-2細胞攝取藏花酸

5、的影響；
　　4．通過藏花酸在Caco-2細胞模型中的攝取轉(zhuǎn)運試驗，研究藏花酸的轉(zhuǎn)運是否由P-糖蛋白介導。
　　結果：
　　1、建立了生物樣品中藏花酸的HPLC檢測方法，并經(jīng)方法學研究，發(fā)現(xiàn)藏花酸與內(nèi)標吲哚美辛分離度良好，藏花酸在0.5～20μM的濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系，回收率、準確度和精密度均滿足要求。該方法操作簡便，靈敏度高，重現(xiàn)性好，結果準確，耐用性良好，能滿足細胞攝取及轉(zhuǎn)運后的藏花酸濃度檢測的要求。

6、
　　2、觀察顯微鏡下的Caco-2細胞培養(yǎng)情況，細胞形態(tài)良好，貼壁緊密；跨膜電阻隨著培養(yǎng)時間逐步增大，TEER值在培養(yǎng)21天后>500Ω·cm2；堿性磷酸酶活性在第3天未檢出，第15、21天檢測時已表現(xiàn)出堿性磷酸酶活性，第21天測出AP/BL的比值達到4.1倍，顯示已具有明顯的極化現(xiàn)象。結合以上各項檢測指標，證明該Caco-2細胞模型可用于后期的藥物轉(zhuǎn)運試驗。
　　3、藏花酸在Caco-2細胞中的攝取與時間及藥物濃度有關。

7、當藏花酸初濃度為180μM時，其在Caco-2細胞中的攝取量在0~30min隨內(nèi)著時間而增加，30min之后基本達到穩(wěn)態(tài)。當藏花酸初濃度在20-80μM時，其在Caco-2細胞中的攝取量和藥物濃度增加呈線性相關。藏花酸初濃度分別在10、20、40μM時，其攝取量比每組加入維拉帕米（60μM）后藏花酸攝取量略高，但無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。
　　4、藏花酸在Caco-2細胞模型的轉(zhuǎn)運實驗中，結果顯示藏花酸在Caco-2細胞模型中

8、的吸收表觀滲透系數(shù)PappAP-BL為5.06×10-6cm·sec-1，PDR為1.52，說明藏花酸在Caco-2細胞模型為中等吸收。在加入維拉帕米60μM后，對其PappAP-BL、PDR均無明顯影響，差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。綜合以上結果表明藏花酸的攝取轉(zhuǎn)運與P-糖蛋白無關，它不是P-糖蛋白的底物。
　　結論：
　　藥物攝取轉(zhuǎn)運試驗證實了藏花酸的攝取轉(zhuǎn)運可能存在雙向轉(zhuǎn)運，且不經(jīng)過P-糖蛋白的轉(zhuǎn)運。以上結果提示藏