EPA和DHA調控CacO-2細胞乳糜微粒組裝的機制研究.pdf

1、日糧脂類中的長鏈脂肪酸（Long chain fatty acid，LCFA）在進入機體前必須在被腸上皮細胞吸收攝取后，經歷一系列轉運及組裝過程，最終以乳糜微粒(Chylomicron，CM)的形式分泌進入循環(huán)系統(tǒng)。為了闡明動物腸上皮細胞轉運日糧中不同種類LCFA的差異，本研究利用Caco-2細胞建立體外腸上皮細胞模型，從單層細胞膜結構的完整性以及酶/功能性蛋白表達兩個方面評價模型的有效性;在此基礎上研究n-3多不飽和脂肪酸(n-3 p

2、olyunsaturated fatty acids，n-3 PUFA)對Caco-2細胞CM合成及分泌的影響，通過放射性同位素標記技術監(jiān)測CM合成過程中兩個重要底物（甘油三酯和載脂蛋白B）的合成情況，解釋在Caco-2細胞合成及分泌CM的過程中觀察到的不同脂肪酸的差異性;考慮到肝型脂肪酸結合蛋白(Liver fatty acidbinding protein，L-FABP)可以攜帶LCFA入核調控基因表達，在揭示了脂肪酸處理與L-FA

3、BP表達量的關系后，構建了L-FABP過表達載體并篩選出了有效抑制L-FABP表達的干擾序列，為后續(xù)機制研究奠定基礎。
　　1.Caco-2單層細胞模型的建立。利用電阻儀測定跨上皮細胞電阻(Transepithelialelectrical resistance，TEER)評價單層膜結構的完整性和致密性，TEER值隨著培養(yǎng)時間的延長呈現(xiàn)穩(wěn)定的上升趨勢，分化20d時TEER值平均可以達到570Ω·cm2;功能性結構的形成通過透射電鏡

4、進行確認，分化21d的Caco-2細胞具有微絨毛及緊密連接這兩個很具有代表性的腸上皮細胞特有的超微結構;堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase，ALP)作為極性分泌的刷狀緣酶可以反應Caco-2細胞的分化進程，培養(yǎng)21d時，ALP幾乎全部集中在頂端刷狀緣一側;L-FABP作為脂質代謝關鍵蛋白，其表達量可以反應脂質代謝等生理功能是否完善，隨著分化的進行Caco-2細胞內L-FABP表達量逐漸增加，在分化成熟的Caco-2細胞中

5、L-FABP表達量很高。
　　2.DHA(Docosahexaenoic acid,22∶6)及EPA(eicosapentaenoic acid,20∶5)對Caco-2細胞CM組裝分泌的影響。MTT試驗分析脂肪酸濃度對Caco-2細胞的脂質毒性發(fā)現(xiàn)，600μmol/L濃度OA(Oleic acid，18∶1)處理下細胞的存活力仍然可以達到95％;往上室培養(yǎng)基中加入[1，2，3-3H]glycerol研究TG合成情況，相比對照組

6、，400μmol/L濃度的脂肪酸處理均可以顯著增加胞內聚集的及培養(yǎng)基中分泌的[3H]triglyceride的量(P＜0.01)，標記的TG的量隨著孵育時間的延長而增加，直到36h時，脂肪酸對TG合成的差異性才顯現(xiàn)出來，相比OA處理組，EPA處理組細胞內聚集的以及培養(yǎng)基中分泌的[3H]triglyceride的量分別降低了16.5％和21％，DHA處理組則分別降低了23.2％和28％(P＜0.01);向上室培養(yǎng)基中加入[1-14C]脂肪

7、酸檢測細胞對不同脂肪酸的攝取效率，上室培養(yǎng)基中放射性元素的消失率及攝取進入細胞的放射性元素的強度都相同(P＞0.05)，在處理12h～24h間約有50％～80％的脂肪酸進入細胞內，下室培養(yǎng)基中放射性元素的強度在三種脂肪酸處理間也沒有差異(P＞0.05);向上室培養(yǎng)基中加入[35S]methionine檢測載脂蛋白B(Apolipoprotein B，apoB)的合成情況，三種脂肪酸處理下，不管是胞內聚集的還是培養(yǎng)基中分泌的被標記的apo

8、B48及apoB100的量都顯著增加(P＜0.01)，EPA和DHA處理組顯著低于OA處理組(P＜0.01)，EPA和DHA處理組之間差異不顯著(P＞0.05);利用密度梯度離心分離測定脂蛋白發(fā)現(xiàn)，相比相同濃度的OA，400μmol/L的EPA和DHA可以顯著降低Caco-2細胞CM的分泌量（P＜0.01）。
　　3.脂肪酸處理與L-FABP表達量之間關系的確定及L-FABP過表達/干擾質粒的構建篩選。400μmol/L的OA、E

9、PA和DHA刺激36h均顯著增加了Caco-2細胞內L-FABP的表達量(P＜0.01)，三種脂肪酸在刺激L-FABP表達的效果上沒有差異(P＞0.05);設計的4條shRNA干擾載體分別與測序正確的過表達載體共轉染293T細胞，利用western檢測L-FABP的表達，驗證了過表達質粒可以有效翻譯形成L-FABP，設計的干擾序列中shRNA2載體的干擾效率最高;轉染Caco-2細胞，干擾組L-FABP的表達量顯著低于干擾對照組(P＜0

10、.01)，過表達組L-FABP的表達量顯著高于過表達對照組（P＜0.01）。為后續(xù)探究脂肪酸對CM組裝分泌的影響是否依賴于L-FABP/PPARα信號通路奠定基礎。
　　以上結果表明:本試驗條件下極性分化完全的Caco-2細胞可以作為研究小腸營養(yǎng)物質吸收代謝的體外模型，用于后續(xù)脂質代謝的相關試驗;相比OA，EPA和DHA抑制Caco-2細胞CM分泌的作用并非由于脂肪酸攝取的差異造成，而是受TG及apoB合成減少的影響。闡明了日糧中