微生物產(chǎn)褐藻膠菌株構(gòu)建及不同來源褐藻膠與腸道菌群互作研究.pdf

1、褐藻膠是一種人體不可缺少的水溶性膳食纖維，有利于減少人體對(duì)蛋白質(zhì)和脂肪的吸收，表現(xiàn)出降低血脂，預(yù)防肥胖、高血脂、以及其他心腦血管疾病的功能。另外，褐藻膠還具有抗腫瘤、預(yù)防結(jié)腸癌、保護(hù)腸道健康、排除體內(nèi)重金屬離子的功能。褐藻膠因其良好的理化性質(zhì)被廣泛應(yīng)用于生物、食品、化妝品、紡織、印染等領(lǐng)域。
　　雖然褐藻膠廣泛存在于巨藻、海帶、昆布、鹿角菜、墨角藻和馬尾藻等上百種褐藻的細(xì)胞壁中，但傳統(tǒng)褐藻膠生產(chǎn)方式即從褐藻中提取褐藻膠的生產(chǎn)方式不

2、可再生，褐藻的養(yǎng)殖環(huán)境容易受到氣候和季節(jié)的影響，不同批次褐藻膠的組成與化學(xué)結(jié)構(gòu)差異大，且生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的堿性或有機(jī)廢水容易造成環(huán)境污染。這些因素限制了褐藻膠以及褐藻膠寡糖的開發(fā)和利用。微生物生產(chǎn)褐藻膠具有生產(chǎn)周期短;生產(chǎn)不受季節(jié)、地域和病蟲害條件的限制;褐藻膠易與菌體分離;生產(chǎn)過程中環(huán)境污染少;容易對(duì)褐藻膠的性狀進(jìn)行控制等優(yōu)點(diǎn)。雖然目前生產(chǎn)成本較高，但具有降低成本的潛力。目前，微生物來源褐藻膠的研究主要集中在棕色固氮菌和銅綠假單胞菌。由

3、于棕色固氮菌發(fā)酵生產(chǎn)褐藻膠的條件要求較高、微生物遺傳操作較難、產(chǎn)量較低，更多的科學(xué)家將目光集中到了利用銅綠假單胞菌產(chǎn)褐藻膠上。
　　本文所述研究，采用海洋轉(zhuǎn)座子突變文庫篩選方法，對(duì)銅綠假單胞菌進(jìn)行基因改造，以期銅綠假單胞菌基因組中調(diào)控褐藻膠產(chǎn)生基因得以過表達(dá)，從而獲得能夠發(fā)酵高產(chǎn)褐藻膠的菌株，并實(shí)現(xiàn)褐藻膠生產(chǎn)。其次采用體外發(fā)酵模型模擬腸道環(huán)境，比較研究褐藻來源褐藻膠與細(xì)菌來源褐藻膠被人體降解的過程、對(duì)腸道內(nèi)短鏈脂肪酸產(chǎn)量的改變、以

4、及對(duì)人體腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響。最后比較研究人體腸道菌群對(duì)不同來源褐藻膠的降解情況，從降解菌藻膠與細(xì)菌來源褐藻膠的菌株，并群中分離培養(yǎng)降解褐藻來源褐進(jìn)行測序鑒定。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.轉(zhuǎn)座子突變文庫篩選獲得了一株褐藻膠高產(chǎn)菌株P(guān)FAC-PAO1。反向PCR測序發(fā)現(xiàn)，突變株褐藻膠的生產(chǎn)可能是由于轉(zhuǎn)座子PFAC上的慶大霉素啟動(dòng)子插入到了銅綠假單胞菌algU基因的上游，導(dǎo)致algU基因過表達(dá)所致。
　　2.利用獲得的銅綠假單胞菌

5、進(jìn)行褐藻膠的發(fā)酵生產(chǎn)。高效離子液相檢測結(jié)果顯示所獲得的多糖由甘露糖醛酸和古羅糖醛酸組成，屬于褐藻膠多糖。其產(chǎn)量為每OD600細(xì)菌生產(chǎn)約32μg褐藻膠。
　　3.利用人體腸道菌群體外模擬發(fā)酵模型研究兩種來源褐藻膠與腸道菌群間的相互作用。薄層色譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明志愿者糞便腸道菌群對(duì)兩種來源褐藻膠的降解情況相似。這兩種來源的褐藻膠在發(fā)酵24h后均被大部分志愿者降解利用，72h后被所有志愿者降解利用。氣相色譜法分析短鏈脂肪酸產(chǎn)量變化結(jié)果顯示，