時(shí)空分辨散射相關(guān)光譜新方法研究及其生物應(yīng)用.pdf

1、分子是保持物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)的最小單元，從單分子的水平上活體、原位、實(shí)時(shí)地研究物質(zhì)之間的相互作用是人類在探索生命奧秘的過程中一直孜孜以求的夢(mèng)想。近年來，不斷發(fā)展的單分子光學(xué)技術(shù)正在促使這一夢(mèng)想轉(zhuǎn)變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)，熒光相關(guān)光譜（Fluorescence Correlation Spectroscopy，F(xiàn)CS）正是這類技術(shù)的一個(gè)典型代表。熒光相關(guān)光譜通過顯微共焦技術(shù)構(gòu)建一個(gè)極小的檢測(cè)微區(qū)（通常小于10-15L），熒光分子或粒子由于布朗運(yùn)動(dòng)或化學(xué)反應(yīng)等動(dòng)

2、力學(xué)過程而不斷進(jìn)出該微區(qū)，引起微區(qū)內(nèi)熒光信號(hào)的漲落即熒光強(qiáng)度隨著時(shí)間而變化。高靈敏度的檢測(cè)器以極高的時(shí)間分辨率捕獲不斷漲落的信號(hào)，這些信號(hào)經(jīng)過自相關(guān)或互相關(guān)分析，就能解析出單分子或單粒子的動(dòng)力學(xué)信息。作為單分子光學(xué)技術(shù)的先驅(qū)，熒光相關(guān)光譜自上個(gè)世紀(jì)七十年代誕生以來，憑借其極高的靈敏度和時(shí)間分辨率以及良好的統(tǒng)計(jì)可靠性，目前已成為研究單個(gè)熒光分子動(dòng)力學(xué)行為的常規(guī)方法，在大分子構(gòu)象、信號(hào)識(shí)別、生化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

3、r>　　但是，熒光相關(guān)光譜也面臨著自身的限制和新的挑戰(zhàn)。一是傳統(tǒng)的熒光探針，包括有機(jī)熒光染料、熒光蛋白、量子點(diǎn)等，在強(qiáng)光或長時(shí)間照射下均存在熒光衰減甚至漂白的現(xiàn)象，此外，量子點(diǎn)還存在熒光閃爍。探針自身熒光強(qiáng)度的變化與動(dòng)力學(xué)過程引起的強(qiáng)度變化疊加在一起，嚴(yán)重干擾檢測(cè)的準(zhǔn)確性。熒光強(qiáng)度不斷衰減的探針也無法滿足生物體系內(nèi)的長時(shí)間實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的要求。二是生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的迅速發(fā)展給分析科學(xué)帶來了新的挑戰(zhàn)，復(fù)雜、不均勻的生物體系要求高通量、多通道的并

4、行檢測(cè)手段。目前的熒光相關(guān)光譜技術(shù)采用共聚焦光學(xué)構(gòu)型，光電倍增管或雪崩二極管（Avalanche Diode，APD）是最常用的檢測(cè)器，所以只能進(jìn)行單窗口檢測(cè)，無法針對(duì)不均勻體系實(shí)現(xiàn)高通量、多通道的并行檢測(cè)。
　　本論文從以上兩個(gè)科學(xué)問題出發(fā)，選擇金屬納米粒子替代傳統(tǒng)的熒光分子作為光學(xué)探針，創(chuàng)造性地引入全內(nèi)反射（Total Internal Reflection，TIR）、暗場(chǎng)（Dark field）等光學(xué)構(gòu)型，使用高靈敏度的電子

5、倍增電荷耦合器件（Electron Multiplying Charge-Coupled Device，EMCCD）作為檢測(cè)器，建立新型波動(dòng)相關(guān)光譜方法，將波動(dòng)相關(guān)光譜擴(kuò)展至更廣的領(lǐng)域，解決以上兩個(gè)問題。主要研究工作包括以下幾個(gè)方面：
　　（1）建立基于全內(nèi)反射構(gòu)型的時(shí)空分辨散射相關(guān)光譜（Spatially Resolved Scattering Correlation Spectroscopy，SRSCS）。首先，我們合成了化學(xué)

6、性質(zhì)穩(wěn)定、尺寸均勻的銀納米粒子，采用其強(qiáng)烈的散射光作為檢測(cè)信號(hào)。在全內(nèi)反射熒光顯微鏡平臺(tái)上，通過使用自制的毫米級(jí)小孔替換原系統(tǒng)的發(fā)射濾光片，將銀納米粒子的散射光與激發(fā)光及其反射光進(jìn)行有效分離，同時(shí)采用電子倍增電荷耦合器件作為檢測(cè)器實(shí)現(xiàn)陣列檢測(cè)。利用這種新型的波動(dòng)相關(guān)光譜方法，我們對(duì)粒徑為16±2 nm的銀納米粒子進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)行為研究，新方法對(duì)納米粒子濃度和擴(kuò)散系數(shù)的變化均有靈敏的響應(yīng)，線性相關(guān)系數(shù)分別為0.998和0.988，檢測(cè)信噪比

7、高達(dá)14.4。實(shí)驗(yàn)表明，這種新方法能高靈敏、高通量、多通道地檢測(cè)納米粒子的濃度、擴(kuò)散速度等動(dòng)力學(xué)信息。此外，我們還研究了不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，證明采樣200000次的檢測(cè)結(jié)果具有可靠的統(tǒng)計(jì)精度。
　?。?）建立基于暗場(chǎng)激發(fā)構(gòu)型的時(shí)空分辨散射相關(guān)光譜（Tempo-Spatially Resolved Scattering Correlation Spectroscopyunder Dark-Field Illuminatio

8、n，DFSCS）。暗場(chǎng)顯微鏡是一種簡(jiǎn)單易用、價(jià)格低廉的光學(xué)顯微鏡，只需在常用的明場(chǎng)顯微鏡上裝配一個(gè)暗場(chǎng)聚光鏡即可實(shí)現(xiàn)。我們首次在暗場(chǎng)顯微構(gòu)型上建立了波動(dòng)相關(guān)光譜檢測(cè)方法。作為波動(dòng)相關(guān)光譜家族中一種全新的光學(xué)構(gòu)型，我們首先推導(dǎo)了DFSCS的理論模型，并提出了評(píng)價(jià)該系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)精度的方法。然后我們通過計(jì)算機(jī)模擬和實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了模型的適應(yīng)性和可靠性。蒙特卡洛模擬（Monte Carlo simulation）得到的粒子濃度和擴(kuò)散系數(shù)與設(shè)定值的差別

9、小于4％。我們還從理論和實(shí)驗(yàn)兩個(gè)角度分別研究了新系統(tǒng)的靈敏度，證實(shí)DFSCS能準(zhǔn)確檢測(cè)納米粒子濃度和擴(kuò)散系數(shù)的變化，線性相關(guān)系數(shù)分別為0.972和0.993，檢測(cè)信噪比高達(dá)17.6。針對(duì)金納米粒子的實(shí)際檢測(cè)結(jié)果表明該系統(tǒng)對(duì)納米粒子的濃度、擴(kuò)散系數(shù)等動(dòng)力學(xué)參數(shù)有靈敏的響應(yīng)。DFSCS的時(shí)間分辨率提高到0.5 ms每幀，單次檢測(cè)的采樣次數(shù)達(dá)到500000次，統(tǒng)計(jì)精度更高。
　?。?）將時(shí)空分辨散射相關(guān)光譜應(yīng)用于研究細(xì)胞內(nèi)納米粒子的動(dòng)力

10、學(xué)行為。我們利用癌癥治療藥物赫賽汀（Herceptin）對(duì)直徑16 nm的金納米粒子進(jìn)行修飾，通過赫賽汀的介導(dǎo)作用將金納米粒子轉(zhuǎn)運(yùn)至人子宮頸癌 SiHa細(xì)胞內(nèi)。這些納米粒子特征性的分布在細(xì)胞膜或不同的細(xì)胞器中。在暗場(chǎng)顯微鏡下，細(xì)胞內(nèi)的金納米粒子散發(fā)出強(qiáng)烈的散射信號(hào)。我們利用時(shí)空分辨散射相關(guān)光譜系統(tǒng)收集這些信號(hào)，研究納米粒子在細(xì)胞內(nèi)不同區(qū)域的動(dòng)力學(xué)行為和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的不均勻性。納米粒子的擴(kuò)散系數(shù)分布在0.056μm2/s至0.235μm2/