靶向FGFR4的miRNA篩選及鑒定研究.pdf

1、目的：肝細(xì)胞癌（HCC）是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一。然而，肝癌進(jìn)展的詳細(xì)分子機(jī)制仍不完全清楚。惡性腫瘤的侵襲和遷移是其治愈率低、治療效果差的主要原因。MicroRNA（miRNA）是一類單鏈非編碼RNA分子，其存在于生理?xiàng)l件下并且長(zhǎng)約19-25nt。它可以通過mRNA的編碼區(qū)或非翻譯區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，直接與靶基因降解或抑制靶基因翻譯過程調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，屬于轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)一類分子。由于其作為基因調(diào)節(jié)因子的重要性，microRNA可以

2、在生理和病理過程中發(fā)揮重要作用，例如生物體發(fā)育和腫瘤發(fā)生。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（FGFR）屬于免疫球蛋白基因超家族。它由胞外區(qū)、單次跨膜區(qū)和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的酪氨酸激酶區(qū)三個(gè)部分組成，可與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growthfactor，F(xiàn)GF）結(jié)合，通過各種不同的信號(hào)傳遞路徑，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移進(jìn)行調(diào)節(jié)。目前已克隆的FGF受體有FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FGFR5，其分布具有組織特異性，F(xiàn)GFR

3、4是唯一存在于成熟靜息狀態(tài)肝細(xì)胞上的FGFR。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體4（fibroblast growth factor receptor4，F(xiàn)GFR4）是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體家族中較晚被發(fā)現(xiàn)的一類跨膜酪氨酸激酶受體。FGFR4通過與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子結(jié)合，啟動(dòng)Ras、PLC等多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與調(diào)控胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷愈合、血管生成、組織分化和修復(fù)等多種生理過程，在胚胎組織和一些生長(zhǎng)活躍的組織內(nèi)中有著較高的表達(dá)，并且在許多腫瘤組織內(nèi)會(huì)出

4、現(xiàn)過表達(dá)，已成為癌癥前期極好的預(yù)測(cè)因子和基因治療的有效靶點(diǎn)。鑒于microRNAs（miRNAs）在腫瘤轉(zhuǎn)移中的至關(guān)重要的作用，我們的目的是分析一個(gè)被命名為miR-340的轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNA在HCC中的表達(dá)和功能：（1）預(yù)測(cè)與FGFR4結(jié)合的miRNA，并篩選與FGFR4表達(dá)負(fù)相關(guān)的miRNA。（2）驗(yàn)證此miRNA與FGFR4的3’-UTR的特異性結(jié)合。（3）研究miRNA表達(dá)對(duì)人肝癌細(xì)胞株生物學(xué)特性的影響。（4）考察miRNA在肝癌

5、及癌旁組織中的表達(dá)及與FGFR4表達(dá)的相關(guān)性。
　　方法：利用miRNA生物信息學(xué)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)分析，尋找肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNA。利用RT-PCR檢測(cè)miR-340在病人的腫瘤組織和癌旁肝組織中以及肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)。利用熒光素酶報(bào)告檢測(cè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證作用于FGFR4的miRNA。利用慢病毒轉(zhuǎn)染方法構(gòu)建miR-340過表達(dá)和低表達(dá)細(xì)胞系。利用western blot檢測(cè)FGFR4表達(dá)水平。利用transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌侵襲和遷移。

6、利用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果：通過三個(gè)常用的miRNA生物信息學(xué)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)與FGFR4相互作用的miRNAs，我們得到3個(gè)miRNA：miR-330-5p，miR-340，miR-3613-5p。根據(jù)RT-PCR和前期Western blot的結(jié)果，我們選擇miR-340作為進(jìn)一步研究的對(duì)象。成功構(gòu)建HepG2-miR-340up、Hep3B-miR-340down實(shí)驗(yàn)組以及其相應(yīng)的陰性對(duì)照空載體質(zhì)粒組。結(jié)合熒光素

7、酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，確認(rèn)了miR-340可以與FGFR4特異性結(jié)合。通過慢病毒轉(zhuǎn)染方法構(gòu)建miR-340過表達(dá)和低表達(dá)細(xì)胞系，通過western blot實(shí)驗(yàn)，證明miR-340與FGFR4呈負(fù)相關(guān)。CCK-8結(jié)果表明，miR-340對(duì)于肝癌細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用。對(duì)肝癌病人癌組織石蠟切塊中miR-340的測(cè)定顯示，其肝癌病人中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常人，且肝癌區(qū)的表達(dá)量低于癌旁正常組織。
　　結(jié)論：成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體4（FG

8、FR4）表達(dá)在肝癌中顯著升高，其表達(dá)水平與多發(fā)結(jié)節(jié)、微血管侵襲、肝癌的總生存率和無病生存率高度相關(guān)。miR-340在肝癌細(xì)胞中的異常表達(dá)會(huì)在很大程度上影響FGFR4的表達(dá)。通過實(shí)驗(yàn)，我們可以確認(rèn)miR-340能夠與FGFR4特異性結(jié)合，并對(duì)FGFR4的表達(dá)具有調(diào)控作用。miR-340過表達(dá)顯著抑制FGFR4的表達(dá)，而miR-340低表達(dá)可使FGFR4表達(dá)升高，二者存在較為顯著的負(fù)相關(guān)性。這些研究結(jié)果共同證明miR-340可以靶向調(diào)控FG