抑制PRRSV增殖的miRNA的篩選.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)基因組全長約15kb，包括九個開放閱讀框（ORFs）。由PRRSV所引起的豬繁殖與呼吸綜合征自報道以來，已經(jīng)對養(yǎng)豬業(yè)造成了重大經(jīng)濟損失。微小核糖核酸(miRNAs)是一類長度為18-23bp的非編碼RNA，可作為一種調(diào)控物質(zhì)在轉(zhuǎn)錄后水平廣泛參與調(diào)控機體生長、發(fā)育等多種生命過程。
　　 PRRSV的遺傳多樣性等特點使得傳統(tǒng)疫苗的交叉保護力不足，為PRRS的防治帶來了不小的困難。而隨著研究的深入，

2、越來越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)具有抗病毒功能，并且miRNA可直接針對病毒基因保守區(qū)域發(fā)揮作用，因此對不同毒株均具有抗病毒作用。本研究以PRRSV的全基因組為模板，希望篩選到能顯著抑制PRRSV在細胞內(nèi)增殖的miRNA，從而為PRRS的防治提供新的依據(jù)。研究內(nèi)容包括以下幾個方面:
　　 1.可能作用于PRRSV基因組的miRNA的預(yù)測和報告質(zhì)粒的構(gòu)建
　　 本研究以PRRSV WuH3株全基因組為模板，將其提交到在線分析軟件

3、Targetscan，根據(jù)miRNA與靶基因的結(jié)合特點選擇了63條可能作用于PRRSV基因組的miRNA，由公司直接合成模擬物。同時，將PRRSV WuH3株ORFs克隆到載體pMIR-report上，成功構(gòu)建報告質(zhì)粒pMIR-WUH3-ORFs。
　　 2.抑制PRRSV增殖的miRNA的篩選
　　 將合成的miRNA模擬物與各報告質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)染HEK-293細胞，利用雙熒光素酶系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)miR-let-7g/7a、

4、miR-3125、miR-379、miR-3165和miR-127-3p共6條miRNA分別能顯著抑制報告質(zhì)粒pMIR-WUH3-NSP2、pMIR-WUH3-ORF5、 pMIR-WUH3-3'UTR、 pMIR-WUH3-5'UTR、pMIR-WUH3-ORF2a/2b的活性。其中miR-let-7g和miR-3125分別能靶向PRRSVNSP2第2037-2061bp和ORF5第14104-14136bp的兩個保守區(qū)域。并且進一步

5、通過Western-blot和空斑實驗證實miR-let-7g和miR-3125顯著抑制PRRSV在Marc-145細胞中的增殖。
　　 3.miR-let-7g和miR-3125不調(diào)控IFN-β的表達
　　 為了探究miR-let-7g和miR-3125是否能調(diào)控IFN-β的表達，將miR-let-7g和miR-3125的模擬物和IFN-β啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)染HEK-293細胞，雙熒光素酶系統(tǒng)檢測結(jié)果表明m

6、iR-let-7g和miR-3125不能激活I(lǐng)FN-β啟動子活性;進一步檢測了miR-let-7g和miR-3125轉(zhuǎn)染細胞后上清對VSV-GFP增值的影響，結(jié)果顯示VSV-GFP增值滴度無顯著變化，說明miR-let-7g和miR-3125不能促進IFN-β的分泌，以上結(jié)果說明miR-let-7g和miR-3125不參與調(diào)控IFN-β的表達。
　　 4.PRRSV感染抑制miR-let-7g和miR-3125的表達
　　

7、 為了探究miR-let-7g和miR-3125的表達是否受PRRSV感染的調(diào)控，本研究利用熒光定量RT-PCR檢測PRRSV感染Marc-145細胞后不同時間點細胞內(nèi)miR-let-7g和miR-3125的表達量，結(jié)果顯示PRRSV感染Marc-145的前12h細胞內(nèi)miR-let-7g和miR-3125的表達顯著降低，miR-let-7g表達量在PRRSV感染36h后恢復(fù)到和對照組一致，miR-3125的表達量則在PRRSV感染2