非小細(xì)胞肺癌吉非替尼耐藥相關(guān)miRNA的篩選與鑒定.pdf

1、研究背景：
　　microRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度約22核苷酸的非編碼單鏈RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。研究表明，miRNA的異常表達(dá)與多種癌癥相關(guān)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，并且與腫瘤細(xì)胞的耐藥性密切相關(guān)。吉非替尼是一種表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI），廣泛應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的臨床治療并取得了良好的療效，但頻繁出現(xiàn)的耐

2、藥現(xiàn)象限制了其進(jìn)一步的發(fā)展。本研究通過miRNA芯片技術(shù)，檢測(cè)吉非替尼耐藥的NSCLC細(xì)胞株與敏感株中miRNA表達(dá)的差異，篩選出與NSCLC耐藥相關(guān)的miRNAs，初步探討miRNA與NSCLC吉非替尼耐藥的關(guān)系。
　　研究方法:
　　1．細(xì)胞培養(yǎng)
　　用含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為保持PC9/GR的耐藥性，該

3、細(xì)胞需培養(yǎng)在含吉非替尼的2μmol/L的上述培養(yǎng)液中，于實(shí)驗(yàn)的前3d更換為無(wú)吉非替尼的上述培養(yǎng)液。細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，3至5d傳代1次，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
　　2．CCK8法測(cè)定PC9/GR對(duì)PC9的耐藥倍數(shù)
　　取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化，制備成單細(xì)胞懸液，PC9/GR以濃度2.5×104mL-1、PC9以2×104mL-1，接種于96孔板中（100μL/孔）。實(shí)驗(yàn)分為PC9/GR組和PC9組，每組分實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。培養(yǎng)24

4、h，分別加入終濃度為0.222、0.667、2、6、18、54μmol/L及0.0056、0.0167、0.05、0.15、0.45、1.35μmol/L的吉非替尼，終體積為200μL，每組濃度4個(gè)復(fù)孔。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，棄去舊液，每孔CCK8與培養(yǎng)液以1:10比例加入，繼續(xù)培養(yǎng)40min，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔OD450值。采用CompuSyn軟件計(jì)算吉非替尼的IC50值（半數(shù)抑制濃度），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　3．

5、總RNA的提取及質(zhì)量檢測(cè)
　　Norgen Biotek試劑盒Total RNA Purification Kit提取總RNA。獲得RNA樣品用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA在230、260和280nm波長(zhǎng)的吸收值，得出RNA濃度并通過 A260/A280及 A260/A230的吸收比值判斷 RNA純度。采用Agilent2100分析儀檢測(cè)RNA完整性。
　　4．miRNA芯片檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析
　　芯片由美國(guó)LC Scie

6、nces公司制作，含有最新版本探針序列（Sanger miRBase Ver.16.0），包括人類已經(jīng)確定的1212個(gè)miRNA探針，每個(gè)探針重復(fù)3次。采用激光掃描儀采集雜交圖象、Array-Pro軟件對(duì)雜交圖像進(jìn)行數(shù)字化轉(zhuǎn)換。數(shù)據(jù)處理和分析首先是扣除背景，計(jì)算重復(fù)點(diǎn)平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，然后通過 LOWESS過濾進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。本實(shí)驗(yàn)為雙色標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，計(jì)算兩種檢測(cè)信號(hào)的比值(log2)和t檢驗(yàn)的p值，以P＜0.01定義顯著差異性表達(dá)。
　

7、　5．熒光定量PCR檢測(cè)miRNA表達(dá)
　　將miRNA芯片分析結(jié)果中差異表達(dá)較顯著且信號(hào)值較高的9個(gè)miRNAs進(jìn)一步行熒光定量PCR分析。分別取2種細(xì)胞總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以U6作為內(nèi)參照。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃20s，1cycle；變性95℃10s,退火60℃20s,延伸70℃5s,40 cycle。反應(yīng)體系：SYBR Green Mix（包括Taq酶、dNTP mix、PCR Buffer、SYBR Green I）

8、9μL，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μL、Forward Primer2μL、Reverse Primer2μL、加水至總體積為20μL。ABI7500 Real-time PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，數(shù)據(jù)采用2－ΔΔCt法進(jìn)行分析。
　　6．miRNA mimics/inhibitor轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)
　　將miRNA mimics（模擬物）及mimics NC（對(duì)照）以50nmol/L濃度轉(zhuǎn)染至PC9/GR中，miRNA inhibitor（抑制劑

9、）及inhibitor NC（對(duì)照）100nmol/L轉(zhuǎn)染至PC9/GR中，24h之后提取其總RNA，熒光定量PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比的miRNA表達(dá)量。
　　7．CCK8法檢測(cè)吉非替尼的敏感性
　　取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC9/GR細(xì)胞以濃度2.5×104mL-1接種于96孔板中，在各實(shí)驗(yàn)組中轉(zhuǎn)染miRNA mimcs/inhibitor，對(duì)照組中轉(zhuǎn)染mimcs/inhibitor NC，24h后加入4μmol/L、8μmol/

10、L吉非替尼，作用72h后CCK8法（步驟同上）檢測(cè)細(xì)胞存活，計(jì)算抑制率。
　　8．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　IC50值采用CompuSyn軟件計(jì)算;各組間比較采用SPSS13.0進(jìn)行單因素方差分析或t檢驗(yàn);檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.01。
　　研究結(jié)果：
　　1．PC9及PC9/GR對(duì)吉非替尼的IC50值及耐藥倍數(shù)
　　CCK8結(jié)果顯示，吉非替尼對(duì)PC9和PC9/GR細(xì)胞的增殖均有抑制作用。吉非替尼對(duì)PC9和PC9/GR細(xì)胞的

11、IC50值分別為42.89nmol/L和3.87μmol/L，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），耐藥倍數(shù)為90.23倍。
　　2．miRNA芯片樣品總RNA的質(zhì)量鑒定結(jié)果
　　從PC9和PC9/GR中提取總RNA，用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)量吸光值，結(jié)果顯示A260/280分別為1.96和1.92，A260/230分別為2.22和2.31，表明所提取的總RNA純度較高。Agilent2100分析儀檢測(cè)結(jié)果顯示28S和18S核

12、糖體RNA亮而濃，28S/18S值PC9為2.0、PC9/GR為1.4，表明總RNA完整性好。質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果表明，總RNA樣品質(zhì)量符合芯片要求。
　　3．PC9和PC9/GR中miRNA表達(dá)譜差異
　　通過對(duì)PC9和PC9/GR中miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P＜0.01的miRNAs有55條，其中在耐藥株P(guān)C9/GR中上調(diào)的有21條，包括miR-1246、miR-125b等；下調(diào)的有34條，包括miR-224、miR-125

13、a-5p等。表達(dá)差異2倍以上的25條。
　　4．熒光定量PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果
　　將 miRNA芯片結(jié)果中差異表達(dá)較顯著且信號(hào)值較高的9條 miRNAs（miR-224、miR-125a-5p、let-7e、miR-99b、miR-762、miR-200b、miR-1246、miR-125b、miR-15a）進(jìn)一步采用熒光定量PCR檢測(cè)，其中8個(gè)miRNA芯片結(jié)果相符，僅miR-15a與芯片結(jié)果相反，提示miRNA芯片結(jié)果基本

14、能正確反映PC9和PC9/GR細(xì)胞株中miRNA的表達(dá)差異。
　　5．轉(zhuǎn)染效率
　　將50nmol/L miR-224 mimics及其NC對(duì)照轉(zhuǎn)染至PC9/GR中，mimics組中miR-224的表達(dá)量相對(duì)與NC對(duì)照組提高了約1502倍；將100nmol/L miR-1246 inhibitor及其NC對(duì)照轉(zhuǎn)染至PC9/GR中，inhibitor組中miR-1246的表達(dá)量相對(duì)與NC對(duì)照組減少了約68%。
　　6．C

15、CK8法檢測(cè)吉非替尼的敏感性
　　進(jìn)一步將miR-224、miR-125a-5p、let-7e、miR-99b、miR-762、miR-200b、NC mimics及miR-1246、miR-125b、NC inhibitor轉(zhuǎn)染至PC9/GR中，予4μmol/L、8μmol/L吉非替尼作用，72h后 CCK法檢測(cè)細(xì)胞存活，觀察 miRNA對(duì)吉非替尼敏感性的影響。
　　在4μmol/L吉非替尼中，miR-125a-5p mi

16、mics組的抑制率相對(duì)于對(duì)照組降低30.55%，P＜0.01；在8μmol/L吉非替尼中，miR-125a-5p mimics組的抑制率相對(duì)于對(duì)照組降低33.03%，P＜0.01。
　　結(jié)論：
　　1．非小細(xì)胞肺癌吉非替尼耐藥細(xì)胞株和敏感細(xì)胞株miRNA表達(dá)差異顯著。
　　2． miRNA芯片是篩選差異表達(dá)miRNA的有效工具。
　　3．轉(zhuǎn)染miRNA mimics/inhibitor可以調(diào)控細(xì)胞中目的miRNA