肝癌組織靶向肽的篩選與鑒定.pdf

1、目的:
　　肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是一種常見且致死率極高的惡性腫瘤，目前對于肝癌的診斷與治療仍存在諸多難點(diǎn)與瓶頸，特別是臨床上應(yīng)用的抗腫瘤藥物，由于缺乏靶向性，對患者造成了極大的副作用。抗腫瘤藥物的靶向性運(yùn)輸是腫瘤治療研究中的重要內(nèi)容，對提高藥物的治療效率和減少毒副作用具有重要的意義。本研究擬利用噬菌體展示文庫及活體切片技術(shù)相結(jié)合，通過體外生物淘選，進(jìn)行新型肝癌組織特異性短肽的篩選和

2、鑒定，以期獲得更高效、特異的肝癌組織靶向肽，為抗腫瘤藥物的靶向性運(yùn)輸提供適合的載體。
　　方法:
　　1.將噬菌體隨機(jī)展示文庫以1×1011 pfu在3種人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、HepG2、MHCC-LM3上進(jìn)行減性篩選，將不與人正常肝細(xì)胞H7702結(jié)合的噬菌體文庫與肝癌細(xì)胞孵育，經(jīng)過3～5輪的體外淘選，篩選肝癌組織靶向短肽，隨機(jī)挑選30～50個(gè)最后一輪回收的噬菌體單克隆，提基因組DNA后測序。
　　2.利用C

3、57BL/6小鼠建立肝活體切片系統(tǒng)，優(yōu)化肝活體切片的體外培養(yǎng)條件，并從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞染色、ATP含量及LDH酶活性四個(gè)方面檢測肝活體切片在體外培養(yǎng)的活力和生存周期，以確定最佳的篩選時(shí)間。
　　3.取臨床病人肝癌標(biāo)本，利用噬菌體隨機(jī)展示文庫以1×1011 pfu在人肝癌活體切片上進(jìn)行四輪體外生物淘選，隨機(jī)挑選30個(gè)最后一輪回收的噬菌體單克隆進(jìn)行常規(guī)測序，并利用高通量二代測序?qū)Φ诙喐患氖删w文庫進(jìn)行測序篩選，獲得重復(fù)率高的候選短肽序

4、列。
　　4.根據(jù)單克隆測序結(jié)果確定候選噬菌體，將1×1011 pfu候選噬菌體及無插入片段的對照噬菌體在人肝癌活體切片上進(jìn)行特異性結(jié)合驗(yàn)證，孵育2小時(shí)后回收結(jié)合的噬菌體，測定滴度。
　　5.根據(jù)測序結(jié)果確定候選靶向短肽，熒光標(biāo)記合成，以5μM的濃度與人正常肝細(xì)胞系及3種肝癌細(xì)胞系共孵育6小時(shí)，利用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀鑒定各細(xì)胞系對短肽的攝取情況。
　　6.將6條熒光標(biāo)記的候選靶向短肽以5μM的濃度與高轉(zhuǎn)移性人肝癌細(xì)

5、胞系 MHCC-LM3及4種人其他腫瘤細(xì)胞包括人宮頸癌細(xì)胞Hela、人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、人腎癌細(xì)胞CRL-1932以及人肺癌細(xì)胞A549共孵育6小時(shí)，利用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀鑒定各細(xì)胞系對短肽的攝取情況，驗(yàn)證候選靶向短肽對肝癌細(xì)胞的特異性。
　　7.將1×107的HepG2細(xì)胞皮下注射到BabL/c裸鼠背部，待皮下瘤長至1cm左右，剝離剪成1mm3的組織塊原位接種到裸鼠肝臟中，建立原位肝癌模型鼠。
　　8.選

6、取候選靶向短肽P46和P47，以25mg/kg的劑量通過尾靜脈注射到肝癌裸鼠模型體內(nèi)，30分鐘后利用小動(dòng)物成像系統(tǒng)對候選短肽進(jìn)行組織分布驗(yàn)證。
　　結(jié)果:
　　1.在3種不同人肝癌細(xì)胞系中的體外淘選，經(jīng)測序未找到重復(fù)序列。
　　2.從四個(gè)方面檢測肝活體切片的活性，證明肝活體切片在培養(yǎng)12小時(shí)內(nèi)形態(tài)正常，活性良好，可以用于噬菌體篩選。
　　3.在人肝癌活體切片上進(jìn)行四輪篩選，通過常規(guī)基因組測序和高通量二代測序確定6

7、條候選靶向短肽及3個(gè)候選噬菌體。
　　4.候選噬菌體P1、P5和P20在人肝癌活體切片中的富集程度均高于對照噬菌體，說明候選噬菌體對肝癌有一定的結(jié)合能力。
　　5.在細(xì)胞攝取試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)6條候選短肽在不同人肝癌細(xì)胞中表現(xiàn)出不同的攝取率，以高轉(zhuǎn)移性人肝癌細(xì)胞系MHCC-LM3中的攝取率最高。與正常人肝細(xì)胞相比，候選短肽P46、P47和P48在肝癌細(xì)胞MHCC-LM3中的攝取率顯著性提高。
　　6.在肝癌細(xì)胞特異性攝取

8、試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)候選短肽P46、P47及P48在人肝癌細(xì)胞MHCC-LM3中的攝取率明顯高于其他類型腫瘤細(xì)胞。
　　7.根據(jù)病理切片及H&E染色驗(yàn)證所建立的肝癌模型為原位肝癌腫瘤組織。
　　8.動(dòng)物組織分布試驗(yàn)結(jié)果顯示:候選短肽P46和P47在肝癌裸鼠模型中表現(xiàn)出對原位肝癌組織的特異靶向性。
　　結(jié)論:
　　本課題成功建立了人肝癌組織活體切片的體外模型，經(jīng)過四輪噬菌體篩選獲得了具有人肝癌組織特異性的候選靶向短肽，