以葡萄糖為唯一碳源合成聚(3-羥基丁酸酯-co-4-羥基丁酸酯)的研究.pdf

1、聚羥基脂肪酸酯(PHA)是一類微生物在胞內(nèi)積累的碳源和能源儲(chǔ)存物質(zhì),具有生物可降解性、熱可塑性,生物相容性,光學(xué)活性,和壓電特性等。因此,PHA作為生物可降解塑料被認(rèn)為是解決由大量廢棄塑料造成的環(huán)境污染問題的希望,而且PHA作為一種新型生物工程材料,在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品業(yè)、醫(yī)藥學(xué)、精細(xì)化工中也極具應(yīng)用前景。
　　 聚3-羥基丁酸[P(3HB)]是PHA中最常見的一種,也是研究和了解得最透徹的一種。但是由于其質(zhì)地發(fā)脆,發(fā)硬,難于加工

2、,其應(yīng)用范圍和價(jià)值受到了很大的限制。如果再其中插入4-羥基丁酸(4HB),形成聚(3-羥基丁酸酯-co-4-羥基丁酸酯)[P(3HB-co-4HB)],可以極大地改善P(3HB)聚合物這一缺點(diǎn)。另外,P(4HB)很容易被生物體內(nèi)的脂肪酶或酯酶降解,并且降解速率相對(duì)其他PHA比較快,可用于制造醫(yī)學(xué)工程材料。
　　 在前期的研究當(dāng)中,P(3HB-co-4HB)的產(chǎn)生需要添加1,4-丁二醇、4-羥基丁酸、γ-丁內(nèi)酯等直接前提物質(zhì),這些

3、物質(zhì)往往比較昂貴,這限制了P(3HB-co-4HB)的生產(chǎn)及應(yīng)用。后來,有研究用葡萄糖為唯一碳源來生產(chǎn)P(3HB-co-4HB),但是4HB在聚合物中含量很低。敲除sad和gabD基因的菌株,可以使得4HB在聚合物中含量提高到11％,但是,4HB的含量還是有限。而且用到的琥珀酸半醛脫氫酶(sucD)和4-羥基丁酸脫氫酶(4hbD)是氧敏感性的酶,這限制了這條代謝途徑在有氧條件下的應(yīng)用。考慮到原料和酶活性的問題,本研究采用在厭氧條件下以葡

4、萄糖為唯一碳源來合成P(3HB-co-4HB)。
　　 已有很多研究證明,厭氧條件下通過TCA循環(huán)的逆循環(huán)可以積累琥珀酸,那么只要表達(dá)琥珀酰輔酶A-輔酶A轉(zhuǎn)移酶(catl)就可以產(chǎn)生琥珀酰輔酶A,然后通過琥珀酸半醛脫氫酶(sucD)、4-羥基丁酸脫氫酶(4hbD)、4-羥基丁酸輔酶A-輔酶A轉(zhuǎn)移酶(cat2),在厭氧條件下即可合成4HB,這樣解決了sucD、4hbD氧敏感性的問題。
　　 本研究選用高產(chǎn)琥珀酸的大腸桿菌工

5、程菌株W3110GAB,其中敲除了ptsG、ldhA、pflB三個(gè)基因,并且采用基因工程手段,外源表達(dá)catl、sucD、4hbD、cat2基因,使得大腸桿菌能夠在厭氧條件下以葡萄糖為唯一碳源來合成P(3HB-co-4HB),驗(yàn)證了該途徑積累P(3HB-co-4HB)的可行性。
　　 本研究采用厭氧發(fā)酵生產(chǎn)P(3HB-co-4HB)的新方法,解決了傳統(tǒng)研究中4HB的生產(chǎn)與sucD、4hbD酶活不高之間的矛盾,為理論研究和工業(yè)生產(chǎn)