枯草芽孢桿菌利用葡萄糖和木糖生產(chǎn)3-羥基丁酮的研究.pdf

1、3-羥基丁酮(乙偶姻)作為一種重要的風(fēng)味化合物,在食品、飲料等行業(yè)中應(yīng)用廣泛。本文圍繞Bacillussubtilis的木糖運(yùn)輸和代謝途徑,以B.subtilis168Δupp為出發(fā)菌株進(jìn)行代謝工程改造,通過(guò)過(guò)表達(dá)木糖運(yùn)輸?shù)鞍譇raE,引入來(lái)自Escherichiacoli的木糖異構(gòu)酶XylA和木酮糖激酶XylB從而建立一條組成型的木糖運(yùn)輸和代謝途徑,使枯草芽孢桿菌能夠同時(shí)利用葡萄糖和木糖進(jìn)行代謝。微氧發(fā)酵條件下,工程菌株在基本鹽培養(yǎng)基

2、中能夠同時(shí)代謝葡萄糖和木糖生產(chǎn)乙偶姻。本研究在B.subtilis中首次報(bào)道了通過(guò)理性工程改造解除碳代謝阻遏效應(yīng)進(jìn)行高附加值化合物乙偶姻的生產(chǎn)。
　　本研究首先對(duì)B.subtilis168Δupp菌株中編碼木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因araE進(jìn)行改造。利用來(lái)自B.subtilis168基因組的組成型強(qiáng)啟動(dòng)子P43過(guò)表達(dá)運(yùn)輸?shù)鞍譇raE,通過(guò)構(gòu)建由強(qiáng)啟動(dòng)子P43、來(lái)自大腸桿菌阻遏蛋白lacI的DNA結(jié)合序列、RBS序列和木糖運(yùn)輸?shù)鞍椎木幋a基因

3、araE組成的木糖運(yùn)輸?shù)鞍妆磉_(dá)序列,工程菌BSUL11能夠在32h耗盡10g/L的木糖,木糖代謝能力得到顯著改善,木糖運(yùn)輸?shù)钠款i得到了有效緩解。
　　其次,為了解除枯草芽孢桿菌中存在的葡萄糖阻遏效應(yīng),通過(guò)在過(guò)表達(dá)木糖運(yùn)輸?shù)鞍譇raE菌株中進(jìn)一步引入來(lái)自E.coliK-12MG1655菌株中編碼木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶的操縱子基因xylAB,建立一條解除轉(zhuǎn)錄調(diào)控的木糖代謝途徑。在完全好氧的條件下,區(qū)別于對(duì)照菌株的葡萄糖優(yōu)先利用,重組菌

4、株能夠同時(shí)代謝利用葡萄糖和木糖,而工程菌BSUL12中測(cè)得的酶活數(shù)據(jù)也反應(yīng)了異源木糖異構(gòu)酶XylA和木酮糖激酶XylB得到了轉(zhuǎn)錄和表達(dá),證明了B.subtilis葡萄糖阻遏效應(yīng)已經(jīng)解除。
　　進(jìn)一步過(guò)表達(dá)戊糖磷酸途徑后,枯草芽孢桿菌菌株的比生長(zhǎng)速率有所下降,反應(yīng)了基因的過(guò)表達(dá)使菌體產(chǎn)生了代謝負(fù)擔(dān)。結(jié)合本研究組前期的工作,代謝工程改造B.subtilis的副產(chǎn)物形成途徑和目標(biāo)產(chǎn)物的降解途徑有利于提高目標(biāo)產(chǎn)物的得率。通過(guò)在工程菌株BS

5、F3中進(jìn)一步引入上述改造,本研究獲得了最優(yōu)菌株BSUL13。微好氧培養(yǎng)條件下,以添加10g/L葡萄糖和5g/L木糖為碳源的基本鹽培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵,結(jié)果顯示工程菌BSUL13主要的代謝產(chǎn)物是乙偶姻且最高產(chǎn)量為5.5g/L,得率為0.70mol/(mol·sugar),達(dá)到了理論得率的75％(對(duì)于10g/L葡萄糖和5g/L木糖的底物,乙偶姻的理論得率為0.937mol/(molsugar)),為今后B.subtilis相關(guān)改造研究和應(yīng)用工作提