表面展示生物合成α-熊果苷的研究.pdf

1、α-熊果苷作為一種安全無毒的美白制劑廣泛添加于各類化妝品中，其生產方式主要靠酶催化合成，但酶合成有諸多不足。本課題嘗試將表面展示系統(tǒng)與酶相結合，從本實驗篩選出的嗜麥芽黃單胞菌(Xanthomonas MaltopHilia BT-112)中擴增出能催化合成α-熊果苷的葡糖基轉移酶XgtA基因，與冰核蛋白Inak進行N端融合將葡糖基轉移酶XgtA展示在細菌表面。將構建出的基因工程菌通過IPTG誘導表達后再通過SDS-PAGE分析，該蛋白在

2、大腸桿菌中能正確表達，且為可溶性蛋白，再利用帶有熒光標簽的抗體與融合蛋白末端帶有的組氨酸標簽結合，通過熒光顯微鏡和流式細胞儀證實了XgtA被展示在細胞表面。
　　本課題對誘導條件進行初步優(yōu)化，得到了最適誘導溫度為15℃，誘導時間為24h，最適IPTG濃度為0.4mmol·L-1。由于對苯二酚存在底物抑制效應，所以本實驗還從提高菌體自身耐受度著手，通過梯度平板篩選將能夠耐受低濃度對苯二酚的菌株篩選出來，并接著利用點種法將初篩菌株進行

3、復篩，最終得到了最大耐受濃度為4％（對苯二酚364mmol·L-1）的菌株。
　　本課題將構建的重組菌BL21-P-I-X進行全細胞催化反應，初步確定了催化反應結束時間為72h，底物為麥芽糖，反應溫度為25℃，pH值為7，對苯二酚與麥芽糖的摩爾比為1∶10，且初始添加對苯二酚濃度為150mmol·L-1。在全細胞催化中人工添加抗氧化劑（抗壞血酸），和黃原膠均能減少對苯二酚對菌體的氧化作用，當添加抗壞血酸為5mmol·L-1時，α-