新型基因組編輯蛋白FnCpf1的表達及其功能的初步探討.pdf

1、目的：
　　構建土拉弗朗西絲菌novicida亞種Cpf1蛋白編碼基因的原核表達質(zhì)粒，在大腸桿菌中誘導表達、純化重組FnCpf1蛋白后，將純化蛋白免疫新西蘭大白兔制備兔抗FnCpf1多克隆抗體，間接ELISA法和Western blot分析制備抗體的免疫反應性及特異性。并對FnCpf1功能做初步的探討。
　　方法：
　　1.以土拉弗朗西絲菌novicida亞種基因組為模板，利用PCR技術擴增FnCpf1基因，將其克隆到

2、原核表達載體pET-32a(+)中，并用雙酶切和測序驗證。
　　2.將構建成功的pET-32a(+)-FnCpf1重組質(zhì)粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導目的蛋白的表達，通過鎳離子金屬螯合磁珠親和純化FnCpf1蛋白。
　　3.將純化蛋白濃縮液與弗氏佐劑充分混合，免疫新西蘭大白兔制備FnCpf1多克隆抗體，并用間接ELISA法檢測兔抗血清效價、Western blot鑒定其特異性。
　　4.構建一個插入失活

3、的mCherry熒光報告載體，將其轉化至表達FnCpf1蛋白的大腸桿菌感受態(tài)中，用肉眼直接觀察是否出現(xiàn)紅色菌落以判斷是否進行了切割、重組。
　　結果：
　　1.擴增得到3900bp目的基因片段，克隆到表達載體pET-32a(+)后，通過雙酶切鑒定大小與預期一致，測序結果與GenBank一致，證實pET-32a(+)-FnCpf1表達載體構建成功。
　　2.可誘導表達相對分子質(zhì)量約為160kD的目的蛋白，經(jīng)SDS-PAG

4、E分析其為可溶性，通過鎳離子金屬螯合磁珠親和純化得到FnCpf1純化蛋白，Image Lab的體積工具分析結果表明純度為95％以上，BCA法測得超濾濃縮后的純化蛋白濃度為1.4mg/ml。
　　3.用純化蛋白免疫新西蘭大白兔3次后，制備多克隆抗體并檢測兔抗FnCpf1抗血清ELISA效價達1:512000，Western blot結果顯示制備的抗體可較好地與FnCpf1蛋白特異性結合。
　　4.將插入失活的mCherry熒光

5、報告載體轉化至表達FnCpf1蛋白的大腸桿菌感受態(tài)中，平板上可見紅色菌落長出，而轉化至大腸桿菌DH5α的則未見紅色菌落。
　　結論：
　　1.成功構建了FnCpf1重組表達載體，并在原核系統(tǒng)中誘導、表達和純化FnCpf1重組蛋白。
　　2.用純化后的蛋白制備出兔抗FnCpf1抗體，效價及特異性均良好，為進一步探討Cpf1蛋白的生物學特性打下實驗基礎。
　　3.在表達FnCpf1的大腸桿菌中，利用CRISPR-Cp