KIT信號(hào)通路在光誘導(dǎo)視網(wǎng)膜損傷過(guò)程中的功能及機(jī)制研究.pdf

1、視網(wǎng)膜變性是一類因視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞逐漸發(fā)生退行性變性而導(dǎo)致視力喪失的異質(zhì)性疾病，主要因感光細(xì)胞發(fā)生凋亡而致盲,目前尚難治愈。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜自身存在神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，主要通過(guò)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子來(lái)阻斷自身細(xì)胞的凋亡或增強(qiáng)細(xì)胞的存活能力，進(jìn)而維持視網(wǎng)膜發(fā)揮正常的視覺(jué)功能。因此，激活視網(wǎng)膜內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)機(jī)制被認(rèn)為是治療視網(wǎng)膜變性疾病的合適策略之一。目前，已發(fā)現(xiàn)多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子能有效地抑制小鼠遺傳性視網(wǎng)膜退行性變性，曾給視網(wǎng)膜變性疾病的治療

2、帶來(lái)曙光，但因其帶來(lái)的系統(tǒng)性副作用以及對(duì)視網(wǎng)膜產(chǎn)生的保護(hù)作用的分子機(jī)制不明等因素依舊制約著常規(guī)的臨床應(yīng)用，且對(duì)視網(wǎng)膜變性疾病的治療效果依舊不理想。因此，尋找更多新的視網(wǎng)膜保護(hù)因子具有迫切性和必要性。為尋找新的視網(wǎng)膜保護(hù)因子，本文通過(guò)利用小鼠光損傷模型及基因表達(dá)譜芯片分析，首次發(fā)現(xiàn)光損傷誘導(dǎo)了KITL在感光細(xì)胞中表達(dá)明顯上調(diào)，并促進(jìn)了其受體KIT的磷酸化水平明顯升高，提示KIT信號(hào)通路在光誘導(dǎo)視網(wǎng)膜損傷過(guò)程中被激活。酪氨酸激酶受體KIT介

3、導(dǎo)的信號(hào)通路在血細(xì)胞形成、配子形成、黑色素細(xì)胞發(fā)育等過(guò)程中均發(fā)揮著重要的生理功能，但在視網(wǎng)膜中的生物學(xué)功能，尚未見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道。為了分析KIT信號(hào)通路在光誘導(dǎo)視網(wǎng)膜損傷過(guò)程中的功能，我利用Kit-Wps突變小鼠模型（以下簡(jiǎn)稱為Wps），通過(guò)眼內(nèi)注射KITL結(jié)合Western Blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Wps突變抑制了視網(wǎng)膜中KIT對(duì)KITL的應(yīng)答而阻斷了KIT信號(hào)通路的活性；隨后通過(guò)光損傷處理結(jié)合視覺(jué)神經(jīng)電生理檢測(cè)、視網(wǎng)膜組織形態(tài)學(xué)分析

4、以及TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)等，發(fā)現(xiàn)Wps突變?cè)谡９庹諚l件下未引起視網(wǎng)膜明顯的異常，但在強(qiáng)光照條件下卻促進(jìn)了光誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜退行性變性，揭示KIT信號(hào)通路在光誘導(dǎo)視網(wǎng)膜損傷過(guò)程中抑制感光細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮著重要的視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)功能。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴氧化損傷被認(rèn)為是神經(jīng)變性疾病的共同特征之一，同樣也出現(xiàn)在光誘導(dǎo)視網(wǎng)膜損傷過(guò)程中。感光細(xì)胞具有大量的線粒體和脂質(zhì)，在強(qiáng)光照環(huán)境下產(chǎn)生大量的活性氧而引起一系列的氧化損傷反應(yīng)，最終導(dǎo)

5、致感光細(xì)胞發(fā)生凋亡。本博士論文研究通過(guò)對(duì)活性氧以及MDA所修飾蛋白的含量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Wps突變促進(jìn)了光誘導(dǎo)的活性氧生成以及MDA修飾蛋白的含量，提示W(wǎng)ps促進(jìn)光誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜氧化損傷；隨后通過(guò)視網(wǎng)膜外植體培養(yǎng)以及感光細(xì)胞661W細(xì)胞系體外研究結(jié)果均顯示， KITL能夠有效地抑制H2O2誘導(dǎo)的感光細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果提示KIT信號(hào)通路影響光誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜氧化損傷，并在視網(wǎng)膜中起到抗氧化作用。⑵為解析KIT信號(hào)通路在光誘導(dǎo)視網(wǎng)膜損傷過(guò)程中所調(diào)控的下

6、游靶分子，研究分析了抗氧化基因在光誘導(dǎo)的Wps純合子小鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)光損傷在野生型小鼠視網(wǎng)膜中能夠誘導(dǎo)血紅素氧化酶1（Hmox1）的表達(dá)明顯上調(diào)，但Wps突變則抑制了光誘導(dǎo)的Hmox1表達(dá)，說(shuō)明光誘導(dǎo)的Hmox1的表達(dá)依賴KIT信號(hào)通路；為進(jìn)一步明確該信號(hào)通路對(duì)Hmox1表達(dá)的調(diào)控，本研究運(yùn)用體外基因過(guò)表達(dá)技術(shù)結(jié)合Western Blot等檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)在感光細(xì)胞661W細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)野生型的KIT能夠明顯上調(diào)HMOX1的表

7、達(dá)，而過(guò)表達(dá)野生型KIT對(duì)HMOX1表達(dá)的調(diào)控作用明顯下降，說(shuō)明該信號(hào)通路在感光細(xì)胞中調(diào)控Hmox1的表達(dá)，同時(shí)Wps突變降低了KIT對(duì)Hmox1的表達(dá)調(diào)控作用。最后，為明確Hmox1在光誘導(dǎo)視網(wǎng)膜損傷過(guò)程中的功能，本研究通過(guò)眼內(nèi)注射結(jié)合腺相關(guān)病毒AAV8-CMV-Hmox1介導(dǎo)的基因過(guò)表達(dá)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)外源性過(guò)表達(dá)HMOX1能夠抑制強(qiáng)光誘導(dǎo)的Wps純合子小鼠視網(wǎng)膜退行性變性以及視覺(jué)功能的退化，揭示該信號(hào)通路可通過(guò)調(diào)控HMOX1來(lái)發(fā)揮視網(wǎng)膜