DEP誘導(dǎo)肺損傷過程中E2F1轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機制研究.pdf

1、目前PM25已經(jīng)成為中國大氣污染的首要污染物，它可以在肺部深處沉積，通過血液循環(huán)進入人體多臟器體系，從而導(dǎo)致廣泛的健康效應(yīng)。柴油尾氣顆粒(diesel exhaust particles，DEP)是機動車尾氣PM25最大的單一來源，2013年世界衛(wèi)生組織將DEP定義為Ⅰ級致癌物。暴露于DEP與呼吸系統(tǒng)疾病及肺癌的發(fā)生密切相關(guān)，盡管已有大量關(guān)于DEP對人體健康影響研究，但DEP與呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生之間的分子機制仍不清楚。E2F轉(zhuǎn)錄因子家族是

2、細胞內(nèi)重要的調(diào)控蛋白，E2F1可以激活DNA合成并誘導(dǎo)靜止期細胞進入S期，這是細胞凋亡、免疫反應(yīng)和慢性炎癥發(fā)生的關(guān)鍵。本研究對A549細胞暴露于DEP后，E2F1及其靶基因的調(diào)控作用開展相關(guān)研究，分別從細胞水平和動物水平探索E2F1參與DEP誘導(dǎo)肺損傷靶基因調(diào)控過程中的分子機制，為DEP導(dǎo)致的細胞毒性相關(guān)機制提供理論依據(jù)和線索。
　　一、DEP暴露對肺泡上皮細胞轉(zhuǎn)錄組表達譜的影響
　　1.A549細胞暴露于50μg/mL D

3、EP24h，采用表達譜芯片技術(shù)檢測A549細胞mRNA及蛋白表達譜的改變。經(jīng)生物信息學(xué)分析篩選出mRNA水平差異表達基因共8000個，其中上調(diào)2512個，下調(diào)5488個（FC≥2且P＜0.05）;蛋白水平差異表達基因共254個，其中上調(diào)167個，下調(diào)87個(FC≥2);其中mRNA及蛋白水平表達趨勢相同的差異表達基因共55個，上調(diào)14個，下調(diào)41個(FC≥2且P＜0.05)。采用轉(zhuǎn)錄因子-基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析，根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控差異表達基因富

4、集數(shù)進行排序，位居前五的轉(zhuǎn)錄因子分別為FLI1、HNF4A、GABP、XPN2及E2F1。其中轉(zhuǎn)錄因子E2F1調(diào)控相關(guān)靶基因14個，包括:NXT1、DDX46、PPIG、DDX17、NUDT21、NXF1、DKC1、MBNL1、YTHDC1、PABPN1、UPF3B、PIN4、NONO及FILIP1。利用Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery(DAVI

5、D)6.7在線基因注釋系統(tǒng)以及Gene Ontology(GO)進行分析，對E2F1調(diào)控差異表達基因進行功能富集分類。結(jié)果顯示:E2F1調(diào)控14個靶基因主要參與RNA加工，RNA剪接，mRNA加工，mRNA代謝過程及RNA轉(zhuǎn)運過程。
　　2.A549細胞分別暴露于0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL DEP24h，應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)，對表達譜芯片結(jié)果進行驗證。50μg/mL、100μg/mL DEP劑量組中E2F1m

6、RNA表達水平顯著下調(diào)(P＜0.05)，50μg/mL劑量組E2F1mRNA表達水平比100μg/mL劑量組低。E2F1調(diào)控相關(guān)靶基因(PPIG、DDX17、NUDT21、NXF1、DKC1、MBNL1、PABPN1、NONO、FILIP1)mRNA下調(diào)趨勢與E2F1一致，qRT-PCR結(jié)果與表達譜芯片結(jié)果存在良好的一致性。因此，DEP暴露可引起A549細胞轉(zhuǎn)錄組表達譜的改變，并導(dǎo)致E2F1調(diào)控相關(guān)基因mRNA表達水平下調(diào)，提示轉(zhuǎn)錄因子

7、E2F1在DEP誘導(dǎo)肺組織損傷過程中可能發(fā)揮重要作用。
　　二、E2F1調(diào)控DEP誘導(dǎo)肺泡上皮細胞的毒性作用
　　為探討E2F1在DEP誘導(dǎo)肺損傷過程中發(fā)揮的重要作用，首先在細胞水平分別從DEP暴露對A549細胞的毒性作用，E2F1調(diào)控DEP致A549細胞毒性作用機制兩方面進行研究。
　　1、DEP暴露對A549細胞的毒性作用
　　1.1 CCK-8比色法檢測暴露于不同濃度DEP（0、12.5、25、50、100

8、、125μg/mL）1、2、3、4、5、6、7天后對A549細胞活力的影響，結(jié)果顯示與對照組相比，暴露于DEP后的A549細胞，細胞增殖活性顯著降低(P＜0.05)，呈且劑量-反應(yīng)關(guān)系。
　　1.2 觀察暴露于DEP24h后A549細胞形態(tài)變化。
　　A549細胞分別暴露于0、12.5、25、50、100、125μg/mL DEP24h，與對照組相比，電子顯微鏡下觀察不同DEP暴露組貼壁生長的細胞數(shù)均減少，細胞固縮呈圓形，偽

9、足消失，透射電子顯微鏡下觀察到DEP顆粒穿過細胞膜，進入A549細胞胞質(zhì)，其中50、100μg/mL染毒劑量組死亡細胞數(shù)目增多，細胞膜出現(xiàn)崩解。
　　1.3 A549細胞分別暴露于0、12.5、25、50、100μg/mL DEP24h，采用流式細胞術(shù)檢測DEP對A549細胞凋亡及細胞周期的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，DEP染毒組的A549細胞凋亡率增加，隨著染毒濃度的增加，細胞凋亡率逐漸升高，并且100μg/mL DEP劑量組

10、的A549細胞死亡率顯著增加(P＜0.05)。細胞周期結(jié)果顯示，暴露于DEP的A549細胞主要阻滯于S期和G2/M期(P＜0.05)。
　　2、E2F1調(diào)控DEP誘導(dǎo)的A549細胞毒性作用機制
　　2.1 pcDNA-3.1-空載質(zhì)粒和pcDNA-3.1-E2F1-His質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細胞48h，利用qRT-PCR、Western Blot分別檢測A549細胞中E2F1mRNA及蛋白表達水平。結(jié)果顯示:與轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組相比

11、，E2F1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，E2F1mRNA表達水平顯著增加(P＜0.05)，同時Western Blot結(jié)果顯示E2F1蛋白表達水平顯著增加(P＜0.05)。證明E2F1過表達A549細胞株構(gòu)建成功。
　　DEP誘導(dǎo)的A549細胞凋亡及細胞周期中的調(diào)控作用。結(jié)果顯示，與空載質(zhì)粒染毒組相比E2F1過表達能夠顯著降低DEP誘導(dǎo)A549細胞凋亡及死亡率(P＜0.05)，同時緩解DEP暴露對A549細胞S期和G2/M期的阻滯作用(P＜0.05

12、)。
　　2.3 E2F1基因過表達的A549細胞經(jīng)0、25、50μg/mL DEP暴露24h，利用qRT-PCR及Western Blot分別檢測E2F1過表達對DEP暴露誘導(dǎo)靶基因(PPIG、DDX17、NUDT21、NXF1、DKC1、MBNL1、PABPN1、NONO及FILIP1)mRNA及蛋白表達水平的影響。
　　由此可知，DEP暴露可引起A549細胞E2F1靶基因mRNA及蛋白表達水平下調(diào)，改變細胞凋亡及細胞周

13、期生物過程，影響A549細胞的增殖活性。過表達E2F1使DEP誘導(dǎo)相關(guān)靶基因mRNA及蛋白表達水平的下調(diào)，部分回復(fù)到正常水平，同時降低暴露于DEP引起的A549細胞凋亡，緩解細胞周期的阻滯作用。提示在DEP暴露誘導(dǎo)肺泡上皮細胞A549產(chǎn)生細胞毒性過程中E2F1可能發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能。
　　三、轉(zhuǎn)基因小鼠染毒模型構(gòu)建
　　構(gòu)建E2F1Tg/Tg過表達轉(zhuǎn)基因小鼠，建立DEP氣管滴注小鼠染毒模型
　　1、E2F1Tg/Tg轉(zhuǎn)

14、基因小鼠構(gòu)建
　　E2F1Tg/Tg轉(zhuǎn)基因小鼠由廣州賽業(yè)生物科技有限公司根據(jù)Tet-on系統(tǒng)構(gòu)建，轉(zhuǎn)基因小鼠繁殖后，提取鼠尾組織DNA，經(jīng)PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定轉(zhuǎn)入組織特異性表達載體Cre，E2F1和攜帶Tet3G的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)基因小鼠。當(dāng)Cre，E2F1，Tet3G同時表達為陽性時，鑒定為陽性轉(zhuǎn)基因小鼠。
　　2、DEP氣管滴注小鼠染毒模型的建立
　　E2F1Tg/Tg轉(zhuǎn)基因小鼠給予強力霉素喂養(yǎng)(喂養(yǎng)濃度為2m

15、g/mL)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)E2F1過表達。將轉(zhuǎn)基因小鼠分為①E2F1Tg/Tg對照組②E2F1Tg/Tg&DEP染毒組③E2F1+/+對照組④E2F1+/+&DEP染毒組，同時進行DEP氣管滴注染毒。
　　四、DEP暴露的體內(nèi)毒性及E2F1調(diào)控作用研究
　　根據(jù)構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因小鼠染毒模型，探討DEP暴露的體內(nèi)毒性及E2F1的調(diào)控作用。
　　1、氣管滴注DEP染毒體內(nèi)一般毒性研究
　　1.1 通過組織整體觀及常規(guī)病

16、理染色方法，觀察各組小鼠臟器病理改變情況。結(jié)果顯示，DEP暴露后的小鼠肺組織出現(xiàn)DEP沉積。與E2F1+/+&DEP染毒組相比，E2F1Tg/Tg&DEP染毒組小鼠出現(xiàn)肺葉萎縮并有灰白色贅生物;肺組織病理HE染色結(jié)果顯示，DEP暴露后小鼠肺組織出現(xiàn)不同程度的病理改變，包括出血、肺泡壁增厚斷裂、肺組織不典型增生，周圍肺泡實變，伴有大量炎細胞浸潤等。
　　3.2 應(yīng)用qRT-PCR及免疫組織化學(xué)染色法，檢測經(jīng)DEP暴露后小鼠肺組織中E

17、2F1調(diào)控相關(guān)基因的表達水平。結(jié)果顯示:氣管滴注DEP小鼠染毒模型中E2F1調(diào)控相關(guān)靶基因mRNA表達水平發(fā)生了改變。與E2F1Tg/Tg對照組相比，E2F1Tg/Tg&DEP染毒組小鼠肺組織中PABPN1、NXF1、PIN4、DDX17基因mRNA表達水平顯著降低(P＜0.05);E2F1+/+&DEP染毒組小鼠隨著轉(zhuǎn)錄因子E2F1表達水平的升高，E2F1所調(diào)控的靶基因PABPN1、NXF1、PIN4、DDX17mRNA表達水平部分回

18、復(fù)到正常水平，且與E2F1Tg/Tg&DEP染毒組存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);免疫組化結(jié)果顯示，DEP染毒組小鼠肺組織中E2F1免疫組化評分顯著降低(P＜0.05)，E2F1+/+小鼠肺組織中E2F1、PANPN1免疫組化評分與E2F1Tg/Tg相比顯著增加(P＜0.05)。
　　綜上，氣管滴注DEP染毒可導(dǎo)致小鼠肺損傷，發(fā)生病理性改變，肺組織中相關(guān)基因表達水平下調(diào)，轉(zhuǎn)錄因子E2F1可對下調(diào)基因起到回復(fù)調(diào)控的作用。提示轉(zhuǎn)錄因子