木聚糖酶基因工程菌G81的構(gòu)建及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、木聚糖是半纖維素的主要組份，其主鏈由β-D-木糖單元通過β-1，4糖苷鍵連接而成。木聚糖帶有不同類型的取代基，例如，阿拉伯糖、葡聚糖等，完全降解木聚糖需要多種水解酶共同參與。木聚糖酶是可降解木聚糖的酶系，其中，β-D-1，4內(nèi)切木聚糖酶及β-D木糖苷酶是最為重要的酶系成員。近十年來，木聚糖酶在飼料、食品、造紙等工業(yè)領(lǐng)域中顯示了廣闊的應(yīng)用前景，現(xiàn)已成為國內(nèi)外酶工程研究的熱點。目前，研究者從不同微生物中克隆出多種木聚糖酶基因，并選擇合適的宿

2、主進行了表達。本研究以黑曲霉C71(A.nigerC71)為出發(fā)菌株，克隆了β-D-1,4內(nèi)切木聚糖酶，即xynB，并在大腸桿菌中得到表達，構(gòu)建了木聚糖酶基因工程菌G81，通過旋轉(zhuǎn)正交實驗，探討了發(fā)酵條件對G81產(chǎn)酶的影響，并對重組酶酶學(xué)性質(zhì)進行了研究。主要研究成果如下：
　　 參考GenBank報道的黑曲霉xynB基因序列，設(shè)計了兩條特異性引物，從A.nigerC71中克隆了xynB基因。DNA序列分析表明，該基因開放閱讀框(

3、ORF)為678bp，可編碼225個氨基酸，理論分子量為24.127kDa，等電點為5.23。同源性分析顯示，編碼的225個氨基酸序列與來源于寧佐美曲霉(A.usamii)xyn的氨基酸序列同源性高達97％，與來源于玉米圓斑病菌（C.carbonum）xyn的氨基酸序列同源性為60％。利用SWISS-MODEL和ESyPred3DWebServer1.0對xynB氨基酸序列進行了序列分析及同源建模，目的蛋白與模板的三維結(jié)構(gòu)模型比較發(fā)現(xiàn)，

4、兩個模型具有數(shù)目相同的二級結(jié)構(gòu)：15個β折疊股和1個a螺旋，且空間結(jié)構(gòu)相互對應(yīng)。其中，前者的β折疊（由Thr168-Arg176組成）比后者的β折疊（由Phe133-Ser138組成）多3個氨基酸。
　　 選用pET32a(+)作為表達載體，設(shè)計限制性酶切位點KpnI和EcoRI；將xynB基因克隆至pET32a(+)上，經(jīng)篩選獲得陽性重組子pET-XYNB；將陽性重組子轉(zhuǎn)化至E.coliBL21中，即基因工程菌G81。搖瓶發(fā)酵

5、液具有較高的木聚糖酶活力，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，蛋白圖譜顯示1條大約為30kDa的特異性條帶。
　　 選用發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和誘導(dǎo)物濃度三個因素設(shè)計了正交旋轉(zhuǎn)組合試驗，構(gòu)建發(fā)酵條件對G81產(chǎn)木聚糖酶影響的數(shù)學(xué)模型：Y=234.38+113.70X1+24.76X2+0.01X3+30.55X1X2-2.52X1X3-2.99X2X3+49.34X12-42.02X22-42.85X32。結(jié)果顯示，G81搖瓶發(fā)酵的最佳條件組

6、合為：發(fā)酵溫度28.6℃，誘導(dǎo)物濃度0.8mmol/L，培養(yǎng)時間15h，其中發(fā)酵溫度對G81產(chǎn)酶影響最為顯著，為主效因子。10L發(fā)酵罐中進行G81擴大培養(yǎng)，結(jié)果表明，G81在10L發(fā)酵罐中最佳發(fā)酵時間為8h：添加誘導(dǎo)物IPTG后6h內(nèi)，木聚糖酶活力上升緩慢，從6h開始，酶活力上升迅速，到8h達到86100.21U，之后酶活力下降，12h后酶活力降到最低。
　　 酶學(xué)性質(zhì)研究表明，G81木聚糖酶于40℃條件下較穩(wěn)定，40℃保溫1h