氨基葡萄糖合酶基因工程菌的構建及重組酶酶學性質的研究.pdf

1、氨基葡萄糖（GlcN）是一些復合寡糖與多聚糖的結構單體。尤其在動物與人類的骨關節(jié)中大量存在GlcN，其能夠修復受損傷的關節(jié)，從而維護骨關節(jié)的健康。氨基葡萄糖合酶在氨基己糖生物合成途徑中具有關鍵作用。GlcN生物合成途徑從EMP途徑產(chǎn)生的6-磷酸果糖（Fru-6-P）開始。氨基葡萄糖合酶催化L-谷氨酰胺（L-Gln）的氨基轉移至Fru-6-P的相應位點上合成6-磷酸氨基葡萄糖（GlcN-6-P），同時GlcN-6-P也可以在氨基葡萄糖合酶

2、作用下可逆轉化為Fru-6-P。隨后在變位酶作用下，生成的GlcN-6-P異構化為1-磷酸氨基葡萄糖（GlcN-1-P），并進一步轉化為UDP-GlcNAc。UDP-GlcNAc是真菌中幾丁質與甘露糖蛋白，細菌中肽聚糖與脂多糖，動物細胞中的脂多糖等生物大分子的前體物。源于哺乳動物的氨基葡萄糖合酶能夠誘導產(chǎn)生糖尿病胰島素阻抗作用。此外，真菌的氨基葡萄糖合酶作為抗真菌理療的潛在位點具有重要的應用價值。目前大腸桿菌（Escherichia c

3、oli）氨基葡萄糖合酶的結構性質研究較深入，而對真核生物的氨基葡萄糖合酶的研究較少，且已報道的研究成果多涉及白色假絲酵母（Cnadina albicans）的氨基葡萄糖合酶。
　　本課題首次利用原核表達體系（E. coli BL21(DE3)，pET-28a）與真核表達體系（Pichia. pastoris SMD1168，pPICZαA）實現(xiàn)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）氨基葡萄糖合酶基因gfa1的

4、過量表達，分離提純出純度較高的氨基葡萄糖合酶（GFA1），對酶的結構性質進行了初步研究，并研究了在E. coli中異源表達GFA1對細胞內GlcN合成量的影響。同時，利用Elson-Morgan法對酶促反應過程中產(chǎn)生的GlcN進行定量，因反應體系內的成分簡單，不存在干擾物，定量較準確。而利用一種HPLC法對胞內GlcN含量進行測定，定量結果較理想。
　　研究結果表明，gfa1不僅可以在原核表達體系中實現(xiàn)表達，也可以在真核表達體系中

5、表達；S. cerevisiae GFA1在E. coli中表達能夠提高胞內GlcN的含量，但維持在一個較低的水平，原因在于GlcN對氨基己糖途徑的抑制作用。S. cerevisiae GFA1的酶學性質與E. coli和C. albicans的氨基葡萄糖合酶具有一定的差異性，而與拜爾結合酵母（Zygosaccharomyces bailii）ISA1307的相似度較高。GFA1在pH4.5-5.5酶活保持穩(wěn)定，殘余酶活為初始酶活的80