氨基葡萄糖合酶基因工程菌的構(gòu)建及重組酶酶學(xué)性質(zhì)的研究.pdf

1、氨基葡萄糖（GlcN）是一些復(fù)合寡糖與多聚糖的結(jié)構(gòu)單體。尤其在動(dòng)物與人類的骨關(guān)節(jié)中大量存在GlcN，其能夠修復(fù)受損傷的關(guān)節(jié)，從而維護(hù)骨關(guān)節(jié)的健康。氨基葡萄糖合酶在氨基己糖生物合成途徑中具有關(guān)鍵作用。GlcN生物合成途徑從EMP途徑產(chǎn)生的6-磷酸果糖（Fru-6-P）開始。氨基葡萄糖合酶催化L-谷氨酰胺（L-Gln）的氨基轉(zhuǎn)移至Fru-6-P的相應(yīng)位點(diǎn)上合成6-磷酸氨基葡萄糖（GlcN-6-P），同時(shí)GlcN-6-P也可以在氨基葡萄糖合酶

2、作用下可逆轉(zhuǎn)化為Fru-6-P。隨后在變位酶作用下，生成的GlcN-6-P異構(gòu)化為1-磷酸氨基葡萄糖（GlcN-1-P），并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為UDP-GlcNAc。UDP-GlcNAc是真菌中幾丁質(zhì)與甘露糖蛋白，細(xì)菌中肽聚糖與脂多糖，動(dòng)物細(xì)胞中的脂多糖等生物大分子的前體物。源于哺乳動(dòng)物的氨基葡萄糖合酶能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生糖尿病胰島素阻抗作用。此外，真菌的氨基葡萄糖合酶作為抗真菌理療的潛在位點(diǎn)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。目前大腸桿菌（Escherichia c

3、oli）氨基葡萄糖合酶的結(jié)構(gòu)性質(zhì)研究較深入，而對(duì)真核生物的氨基葡萄糖合酶的研究較少，且已報(bào)道的研究成果多涉及白色假絲酵母（Cnadina albicans）的氨基葡萄糖合酶。
　　本課題首次利用原核表達(dá)體系（E. coli BL21(DE3)，pET-28a）與真核表達(dá)體系（Pichia. pastoris SMD1168，pPICZαA）實(shí)現(xiàn)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）氨基葡萄糖合酶基因gfa1的

4、過量表達(dá)，分離提純出純度較高的氨基葡萄糖合酶（GFA1），對(duì)酶的結(jié)構(gòu)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，并研究了在E. coli中異源表達(dá)GFA1對(duì)細(xì)胞內(nèi)GlcN合成量的影響。同時(shí)，利用Elson-Morgan法對(duì)酶促反應(yīng)過程中產(chǎn)生的GlcN進(jìn)行定量，因反應(yīng)體系內(nèi)的成分簡(jiǎn)單，不存在干擾物，定量較準(zhǔn)確。而利用一種HPLC法對(duì)胞內(nèi)GlcN含量進(jìn)行測(cè)定，定量結(jié)果較理想。
　　研究結(jié)果表明，gfa1不僅可以在原核表達(dá)體系中實(shí)現(xiàn)表達(dá)，也可以在真核表達(dá)體系中

5、表達(dá)；S. cerevisiae GFA1在E. coli中表達(dá)能夠提高胞內(nèi)GlcN的含量，但維持在一個(gè)較低的水平，原因在于GlcN對(duì)氨基己糖途徑的抑制作用。S. cerevisiae GFA1的酶學(xué)性質(zhì)與E. coli和C. albicans的氨基葡萄糖合酶具有一定的差異性，而與拜爾結(jié)合酵母（Zygosaccharomyces bailii）ISA1307的相似度較高。GFA1在pH4.5-5.5酶活保持穩(wěn)定，殘余酶活為初始酶活的80