水稻白葉枯病菌c--di--GMP信號(hào)受體Filp及其互作蛋白PXO_02715共調(diào)控元的鑒定與功能分析.pdf

1、環(huán)二鳥(niǎo)苷酸(c-di-GMP)信號(hào)途徑參與了水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)毒性、胞外多糖產(chǎn)生、生物膜形成和運(yùn)動(dòng)性等表型的調(diào)控。不同類(lèi)型的信號(hào)受體在信號(hào)識(shí)別、接受和傳遞過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。其中信號(hào)受體Filp可與PilZ結(jié)構(gòu)域蛋白PXO_02715互作，共調(diào)控了病菌毒性及其相關(guān)基因的表達(dá)。然而，F(xiàn)ilp/PXO_02715是通過(guò)何種信號(hào)傳遞途徑對(duì)毒性表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的機(jī)理尚不清楚。因此，

2、本研究對(duì)Filp/PXO_02715共調(diào)控元進(jìn)行了功能鑒定分析，為闡明c-di-GMP信號(hào)途徑及其毒性調(diào)控機(jī)理提供了科學(xué)依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.Filp/PXO_02715共調(diào)控蛋白的篩選和鑒定:采用iTRAQ方法，對(duì)野生型菌株P(guān)XO99A、單基因缺失突變體△filp和△PXO_02715、雙基因缺失突變體△filp△PXO_02715進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析。發(fā)現(xiàn)了108個(gè)受Filp和PXO_02715共調(diào)控的蛋白質(zhì)，

3、它們涉及到多種細(xì)胞功能的調(diào)控。從中選取了10個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行后續(xù)研究，包括PXO_00476(HD-GYP結(jié)構(gòu)域雙組分系統(tǒng)應(yīng)答蛋白)、PXO_01515(LuxR/uhpA家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控子)、PXO_01585(PhoPQ調(diào)控蛋白)、PXO_01644和PXO_01883(TonB依賴(lài)型受體蛋白)、PXO_03510(前噬菌體蛋白)、PXO_04157（組氨酸激酶-應(yīng)答調(diào)控子雜合蛋白）、PXO_04752（趨化性蛋白）、PXO_04753(E

4、AL結(jié)構(gòu)域應(yīng)答調(diào)控子)和PXO_05583(磷結(jié)合蛋白PstS)。
　　2.Filp/PXO_02715共調(diào)控蛋白表達(dá)模式的驗(yàn)證:分別制備了上述10個(gè)蛋白的多克隆抗體，提取了PXO99A、△filp、△PXO_02715和△filp△PXO_02715細(xì)胞全蛋白;以GAPDH作為內(nèi)參，對(duì)10個(gè)蛋白的表達(dá)進(jìn)行了Western Blot驗(yàn)證。結(jié)果表明，6個(gè)蛋白(PXO_00476、PXO_01515、PXO_01883、PXO_047

5、52、PXO_04753和PXO_05583)在突變體（△filp、△PXO_02715和filp△PXO_02715）中的表達(dá)量均比在PXO99A中的低;其他4個(gè)蛋白(PXO_01585、PXO_01644、PXO_03510和PXO_04157)在3個(gè)突變體中的表達(dá)量均比在PXO99A中的高。這些蛋白表達(dá)驗(yàn)證結(jié)果與iTRAQ分析結(jié)果相一致。
　　3.Filp/PXO_02715共調(diào)控蛋白基因轉(zhuǎn)錄分析:采用qRT-PCR方法，定

6、量分析了上述10個(gè)蛋白編碼基因在PXO99A及其突變體(△filp、△PXO02715和△filp△PXO_02715)中的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，6令基因(PXO_00476、PXO_01515、PXO_01883、PXO_04752、PXO_04753和PXO_05583)在突變體(△filp、△PXO_02715和△filp△PXO_02715)中的轉(zhuǎn)錄本均比在PXO99A中的低;其他4個(gè)基因(PXO_01585、PXO_01644、

7、PXO_03510和PXO_04157)在3個(gè)突變體中的轉(zhuǎn)錄本均比在PXO99A中的高。10個(gè)基因轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)趨勢(shì)相一致。
　　4.Folp/PXO_02715共調(diào)控蛋白的功能分析:分別構(gòu)建了上述10個(gè)基因用于缺失突變分析的自殺載體，成功獲得了△PXO_00476、△PXO_04157和△PXO_04752基因缺失突變體及其相應(yīng)的互補(bǔ)菌株，測(cè)定了其致病性、運(yùn)動(dòng)性、胞外多糖(EPS)產(chǎn)生、生物膜形成、以及胞外纖維素酶和木聚糖酶活性

8、等表型。結(jié)果表明，PXO_00476和PXO_04752正調(diào)控細(xì)菌毒性，而PXO_04157負(fù)調(diào)控了毒性。與PXO99A相比，△PXO_00476、△PXO_04157和△PXO_04752運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng);△PXO_00476、△PXO_04157和△PXO_04752 EPS產(chǎn)生量增加;△PXO_04157和△PXO_04752生物膜形成能力增強(qiáng)，而△PXO_00476生物膜形成能力減弱;△PXO_00476、△PXO_04157和△PX

9、O_04752胞外纖維素酶和木聚糖酶活性無(wú)明顯變化。全長(zhǎng)基因互補(bǔ)可使突變體表型恢復(fù)到與野生型相似的水平。另外，△PXO_00476胞內(nèi)c-di-GMP濃度明顯比PXO99A的高，表明PXO_00476可能具有磷酸二酯酶(PDE)活性，參與了c-di-GMP信號(hào)降解，從而調(diào)控了致病性、生物膜形成能力、運(yùn)動(dòng)性和EPS產(chǎn)生能力。
　　總之，本研究鑒定了10個(gè)受Filp/PXO_02715共調(diào)控的蛋白，驗(yàn)證了其在蛋白翻譯和基因轉(zhuǎn)錄水平上的