水稻白葉枯病菌磷酸二酯酶PdeR互作蛋白鑒定及其功能研究.pdf

1、水稻白葉桔病是由黃單胞菌水稻致病變種(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，簡稱Xoo)侵染引起的，是世界水稻生產(chǎn)上重要的細(xì)菌病害之一。病原菌主要通過水孔或傷口侵入水稻木質(zhì)部，Ⅲ型分泌系統(tǒng)及其效應(yīng)子、胞外多糖(EPS)、胞外酶等毒性因子在Xoo致病性中起關(guān)鍵作用。c-di-GMP是細(xì)菌中廣泛存在的第二信使，可以調(diào)控生物膜形成、運(yùn)動(dòng)性、毒性、細(xì)胞周期等生物學(xué)表型，含有GGDEF結(jié)構(gòu)域的鳥苷酸環(huán)化酶(DGC)和含有EAL

2、或HD-GYP結(jié)構(gòu)域的磷酸二酯酶(PDE)分別控制c-di-GMP的合成與降解。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，PdeR是一個(gè)含有GGDEF-EAL-REC多結(jié)構(gòu)域的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白，具有PDE酶活性降解c-di-GMP，與組氨酸激酶PdeK組成一對雙組份系統(tǒng)，參與調(diào)控EPS產(chǎn)生和Xoo毒性。為了進(jìn)一步探索PdeR對Xoo毒性調(diào)控的分子機(jī)理，本研究從尋找PdeR的互作蛋白入手，并對互作蛋白的功能進(jìn)行解析，旨在闡明PdeR的作用機(jī)制，為全面揭示c-di

3、-GMP信號(hào)途徑和細(xì)菌致病機(jī)理提供更多的科學(xué)依據(jù)。取得的主要進(jìn)展如下:
　　1.PdeR互作蛋白的篩選和鑒定
　　本研究構(gòu)建了PXO99A菌株的cDNA文庫，采用酵母雙雜交(Y2H)方法，以PdeR蛋白為誘餌蛋白，進(jìn)行了cDNA文庫篩選，以獲得PdeR的互作蛋白。Y2H和GST pull-down驗(yàn)證了2個(gè)互作蛋白PXO04421(命名為TriP)和PXO_00987。發(fā)現(xiàn)隨著互作反應(yīng)體系中c-di-GMP濃度增加，TriP

4、與PdeR結(jié)合作用受到抑制。TriP為OmpR/PhoB家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之一，其N端含有信號(hào)接收結(jié)構(gòu)域(REC)、C端含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(HTH)，推測可能具有調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄的功能。PXO_00987為乙酰轉(zhuǎn)移酶之一，其編碼基因位于Xoo鞭毛基因簇的糖基化島中，推測其可能參與調(diào)控鞭毛運(yùn)動(dòng)性。
　　2.轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TriP功能研究
　　本研究首先通過同源置換法構(gòu)建了triP缺失突變體(ΔtriP)，進(jìn)一步測定了其表型及毒性

5、變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與野生型PXO99A相比，triP突變后EPS產(chǎn)量降低、Xoo毒性減弱，但鞭毛運(yùn)動(dòng)性未受影響，與pdeR突變體表型一致，表明兩者可能位于同一信號(hào)通路中。進(jìn)一步通過RNA-seq技術(shù)分析ΔtriP及ΔpdeR突變體中差異基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)ΔtriP突變體傾向于激發(fā)一些基因的高表達(dá)，而ΔpdeR突變體除了能夠激發(fā)一些基因高表達(dá)外，更傾向于抑制一些基因的表達(dá)，兩者既有共同的調(diào)控通路，也有各自不同的調(diào)控通路。
　　3.乙酰轉(zhuǎn)

6、移酶PXO_00987功能研究
　　本研究通過同源置換法構(gòu)建了PXO_00987基因缺失突變體(ΔPXO_00987)，進(jìn)一步測定了突變體的表型及毒性變化。發(fā)現(xiàn)與PXO99A相比，ΔPXO_00987的EPS產(chǎn)量降低、鞭毛運(yùn)動(dòng)性增加、生物膜形成減少及Xoo致病性減弱，我們推測Xoo致病性減弱可能與毒性因子減少有關(guān)。此外，PXO_00987位于預(yù)測的糖基化島中，可能參與鞭毛蛋白翻譯后修飾作用，因此從野生型及ΔPXO_00987突變體

7、中提取鞭毛蛋白進(jìn)行糖基化檢測，發(fā)現(xiàn)ΔPXO_00987中鞭毛素(FliC)蛋白糖基化作用缺失，表明PXO+00987可能參與了FliC糖基化修飾。
　　4.PdeR亞細(xì)胞定位研究
　　本研究通過構(gòu)建PdeR-GFP融合表達(dá)載體，觀察其亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)PdeR主要定位在細(xì)胞兩極。進(jìn)一步研究結(jié)構(gòu)域?qū)ζ涠ㄎ坏挠绊懀l(fā)現(xiàn)GGDEF及REC結(jié)構(gòu)域缺失后影響PdeR的極端定位;同時(shí)研究了互作蛋白PdeK、TriP對PdeR定位的影響，發(fā)

8、現(xiàn)TriP影響PdeR的極端定位，因此，PdeR亞細(xì)胞定位受到互作蛋白TriP的影響，且REC、GGDEF結(jié)構(gòu)域是影響PdeR亞細(xì)胞定位的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。
　　總之，本研究通過對PdeR互作蛋白功能的研究，表明反應(yīng)調(diào)控因子TriP參與了PdeR介導(dǎo)的c-di-GMP信號(hào)途徑，而乙酰轉(zhuǎn)移酶PXO_00987具有自己的調(diào)控功能，參與鞭毛蛋白糖基化修飾過程，是否參與PdeR介導(dǎo)調(diào)控途徑尚不清楚。通過對PdeR亞細(xì)胞定位研究，發(fā)現(xiàn)PdeR主要