五糧液酒醅中芽孢桿菌的分離鑒定及其產生的抑菌物質.pdf

1、傳統(tǒng)白酒釀造過程中，以酒曲為發(fā)酵劑的酒醅中含有種類豐富的微生物，這些微生物除引起乙醇發(fā)酵和產生風味物質外，有的也產生其他重要的功能性物質?；诰契泻写罅垦挎邨U菌的現象，本論文從著名白酒產品五糧液酒醅中采取樣品，分離其中的芽孢桿菌，篩選具有抑菌活性的菌株，進而分析產生的抑菌物質的本質，確定其抑菌譜、抑菌基因等生物和理化特性。
　　通過通過形態(tài)學觀察、生理生化試驗等常規(guī)培養(yǎng)技術從酒醅樣品中分理出芽孢桿菌125株，以黑曲霉作為指示菌

2、，經抑菌試驗篩選出一株抑菌活性明顯的解淀粉芽孢桿菌，命名為解淀粉芽孢桿菌WY047(Bacillus amyloliquefaciens WY047)。進一步抑菌試驗發(fā)現，該菌株有廣譜抑菌活性，除對真菌有明顯抑制作用外，對部分革蘭氏染色陽性細菌、革蘭氏染色陰性細菌也具有抑菌作用。
　　通過PCR擴增，從芽孢桿菌WY047中檢測出bmyD、fenA、hag、ituA、mrsA和tasA等抑菌物質基因，表明該菌株可能產生桿菌抗霉素（b

3、acillomycin D）、芬薺素（fengycin）、鞭毛蛋白（flagellin）、伊枯草菌素（iturin A）、美殺菌素（mersacidin）、TasA蛋白等相對應的抑菌物質。
　　為分離鑒定解淀粉芽孢桿菌WY047發(fā)酵液中抑菌蛋白，發(fā)酵液上清中的蛋白經飽和硫酸銨沉淀后，所得蛋白粗提物通過葡聚糖凝膠層析和陰離子色譜柱進一步純化，采用SDS-PAGE凝膠電泳技術發(fā)現具有抑菌活性的峰1的洗脫液呈現單一條帶，對此條帶切膠回收

4、后使用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀，確定該蛋白是鞭毛蛋白（flagellin），分子量為35207 Da。由于TasA產生于孢子分化的過渡期蛋白，此試驗中沒有成功分離得到。
　　為分離鑒定解淀粉芽孢桿菌WY047發(fā)酵液中抑菌肽，解淀粉芽孢桿菌WY047的上清液經鹽酸沉淀后得到，所得脂肽粗提物經半制備C18反相高效液相色譜分離后，由HPLC/UV-MS液質聯(lián)用儀器測定每一個組分的核質比，發(fā)現該菌株產生桿菌抗霉素（bacillo

5、mycin D）、芬薺素（fengycin）、伊枯草菌素（iturin A）、美殺菌素（mersacidin）等多肽。
　　菌株培養(yǎng)后經離心除菌提取發(fā)酵液粗提物，以黑曲霉為指示菌，測定發(fā)酵液中抑菌物質對熱、酸、堿、酶及有機溶劑的穩(wěn)定性。表明粗提物具有一定的熱穩(wěn)定性，對酸堿不敏感，在胰蛋白酶、胃蛋白酶、α-淀粉酶的作用下依然保持抑菌活性，對甲醇、乙醇、乙腈等有機溶劑具有穩(wěn)定性。
　　為檢測上述抑菌基因在芽孢桿菌中的分布，對80

6、株芽孢桿菌進行了測定。其中擁有hag基因的菌株為61株，擁有fenA基因的菌株為52株，擁有ituA基因的菌株為45株，擁有bmyD基因的菌株為41株，而mrs基因在芽孢桿菌中的分布最少，僅在11株芽孢桿菌中發(fā)現 mrs基因。同時 hag-fenA-ituA和hag-fenA-bmyD的組合基因在所測定的芽孢桿菌中最常見，分別在40株和34株芽孢桿菌中發(fā)現這兩種基因組合。同時，一株芽孢桿菌中分布有4種抑菌基因的菌株最多，在31株芽孢桿菌