DHHC型鋅指蛋白基因OsDHHC1在水稻株型構(gòu)建中的功能分析.pdf

1、隨著水稻基因組測(cè)序的完成,很多水稻基因的功能已經(jīng)陸續(xù)被報(bào)道,但DHHC型鋅指蛋白基因在水稻中的具體功能還研究甚少,大部分基因功能未見(jiàn)報(bào)道。因此,本文對(duì)水稻中DHHC型鋅指蛋白開(kāi)展了生物信息學(xué)分析及基因功能研究,獲得了如下主要研究結(jié)果:
　　 (1)采用同源對(duì)比的方式克隆了1個(gè)新的DHHC型鋅指蛋基因OsDHHC1。通過(guò)同源對(duì)比的方式找到了水稻中與調(diào)控?cái)M南芥的分枝基因At5g04270編碼的氨基酸序列高度相似的DHHC型鋅指蛋白基

2、因Os02g0819100,長(zhǎng)度約800bp。采用RT-PCR技術(shù)克隆Os02g0819100基因時(shí)發(fā)現(xiàn)了一條大小約800bp的弱帶和一條700bp左右的亮帶,測(cè)序結(jié)果顯示這條亮帶是從Os02g0819100基因開(kāi)放閱讀框里去掉112-259位點(diǎn)之間的147bp后剩余序列的拼接結(jié)果。它有完整的開(kāi)放閱讀框且能夠通讀。但是該基因在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有收藏,說(shuō)明這是我們克隆獲得的一個(gè)新基因,將其命名為OsDHHC1,并明確了OsDHHC1是O

3、s02g0819100在水稻體內(nèi)的另一種剪接方式。
　　 利用生物信息學(xué)方法分析了OsDHHC1和Os02g0819100的核酸及其編碼氨基酸序列,利用同源建模方法構(gòu)建了OsDHttC1和Os02g0819100蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型。研究發(fā)現(xiàn)OsDHHC1和Os02g0819100都是膜蛋白,其中OsDHHC1存在3個(gè)主要的跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)次要的跨膜結(jié)構(gòu)域,而Os02g0819100有四個(gè)主要的跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)次要的跨膜結(jié)構(gòu)域。2

4、個(gè)蛋白都具有DPG、DHHC-CRD和TTxE3個(gè)S-?；D(zhuǎn)移酶的motif和S-?；D(zhuǎn)移酶的活性中心,預(yù)測(cè)該蛋白應(yīng)該具有S-酰基轉(zhuǎn)移酶活性。
　　 (2)揭示了OsDHHC1基因的時(shí)空表達(dá)特性及其編碼蛋白的亞細(xì)胞定位,初步考察了OsDHHC1基因在脅迫應(yīng)答中所發(fā)揮的作用。明確了OsDHHC1是Os02g0819100在水稻體內(nèi)的另一種剪接方式,但主要以O(shè)sDHHC1的剪接方式在植物體內(nèi)發(fā)揮作用。分析發(fā)現(xiàn)該基因的啟動(dòng)子上存在很多

5、與光、冷、熱、旱、鹽等脅迫和ABA響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件。Q-PCR結(jié)果顯示ABA處理2周齡的幼苗后,該基因的2種剪接方式mRNA的總表達(dá)量相比處理前增加了45倍,說(shuō)明該基因的轉(zhuǎn)錄受ABA的誘導(dǎo)。GFP融合蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)分析顯示,OsDHHC1和Os02g0819100這2個(gè)蛋白都定位在細(xì)胞膜上。OsDHHC1::GUS實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所克隆的OsDHHC1基因上游的1639bp的DNA片段具有完整的OsDHHC1基因的啟動(dòng)

6、子活性,能夠調(diào)控OsDHHC1基因的時(shí)空表達(dá)特異性,控制該基因在胚和葉脈中高量表達(dá)。
　　 (3)利用體外重組蛋白和酵母形態(tài)觀察2種方式證明了OsDHHC1和Os02g0819100蛋白都具有S-?；D(zhuǎn)移酶活性。第一種方式是構(gòu)建了載體pColdTF-OsDHHC1和pColdTF-Os02g0819100,并對(duì)這2個(gè)基因編碼蛋白進(jìn)行了大腸桿菌表達(dá),純化得到了大量可溶的重組蛋白,然后采用生物素(biotin-HPDP)標(biāo)記法證明了

7、2個(gè)蛋白具有S-?；D(zhuǎn)移酶活性。另一種方式是構(gòu)建了載體PYES263-OsDHHC1和PYES263-Os02g0819100,并轉(zhuǎn)化S-酰基轉(zhuǎn)移酶缺失的酵母菌株akl△,通過(guò)酵母形態(tài)觀察確定了這2個(gè)基因的S-?；D(zhuǎn)移酶的活性。
　　 (4)構(gòu)建了pCAMBIA1301-OsDHHC1,pCAMBIA1301-Os02g0819100過(guò)表達(dá)載體和OsDHHC1-RNAi18干擾載體,通過(guò)農(nóng)桿菌浸染愈傷組織的方法轉(zhuǎn)化水稻中花11。

8、過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)化純合子表型表明OsDHHC1轉(zhuǎn)基因植株的分蘗數(shù)比野生型增加了23％-31％,畝產(chǎn)比野生型增加了9.6％,而Os02g0819100轉(zhuǎn)基因植株沒(méi)有較野生型在分蘗和產(chǎn)量上都沒(méi)有明顯的變化。干擾OsDHHC1-RNAi18植株的轉(zhuǎn)化純合子表型顯示OsDHHC1表達(dá)量降低對(duì)分蘗數(shù)和產(chǎn)量沒(méi)有明顯的影響。
　　 同時(shí)我們構(gòu)建了PEGAD-OsDHHC1的過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥,純合子表型與前述表型一致。這些結(jié)果說(shuō)明OsDHHC1的

9、主要功能是通過(guò)增加分蘗(枝)來(lái)構(gòu)建合理株型從而增加作物的產(chǎn)量。
　　 (5)闡明了OsDHHC1的功能域是含有DHHC鋅指結(jié)構(gòu)域的motif。將OsDHHC1基因分成OsDHHC1A,OsDHHC1B和OsDHHC1C等3段,分別克隆到PEGAD表達(dá)載體上并轉(zhuǎn)化擬南芥,純合子表型顯示包含有DHHC結(jié)構(gòu)域的OsDHHC1A的轉(zhuǎn)基因植株的分支數(shù)比野生型增加了3-6倍,與OsDHHC1的全長(zhǎng)CDS過(guò)表達(dá)擬南芥的表型一致,由此可知該基因

10、的功能域應(yīng)該是含有DHHC結(jié)構(gòu)域的OsDHHC1A片段。
　　 綜上所述,本研究首次克隆了1個(gè)新的DHHC型鋅指蛋白基因OsDHHC1,系統(tǒng)地研究了該基因的功能,并發(fā)現(xiàn)了它是Os02g0819100基因在水稻體內(nèi)的另一種剪接方式,但主要以O(shè)sDHHC1這種剪接方式在水稻體內(nèi)發(fā)揮促進(jìn)水稻分蘗、構(gòu)建合理株型以增加水稻產(chǎn)量的功能。明確了該基因在胚和葉脈里高量表達(dá),且受ABA誘導(dǎo)表達(dá)。通過(guò)兩種方式證明了OsDHHC1具有S-?；D(zhuǎn)移酶的