鏈霉素藥渣危害因子確證及其誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥機(jī)制研究.pdf

1、鏈霉素藥渣是生物發(fā)酵生產(chǎn)鏈霉素過程中產(chǎn)生的工業(yè)廢棄物，其含有一定濃度的粗蛋白和未被完全提取的鏈霉素，并且含有危害尚不明確的次級(jí)代謝產(chǎn)物，若將其飼喂動(dòng)物存在食品安全隱患和誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥性風(fēng)險(xiǎn)。目前，國(guó)內(nèi)外尚未開展鏈霉素藥渣危害因子分析和誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，而且尚無(wú)飼料中鏈霉素藥渣確證分析方法。為了有助于實(shí)現(xiàn)有效的“事后監(jiān)管”和充分的“事前預(yù)警”，本研究開展了鏈霉素藥渣危害因子識(shí)別、飼料中鏈霉素藥渣確證分析方法開發(fā)、危害因子誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥

2、性風(fēng)險(xiǎn)分析及誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥的機(jī)制研究。具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.鏈霉素藥渣危害因子識(shí)別。將鏈霉素及其生物合成中間產(chǎn)物（共25種）作為危害因子靶向篩查范圍，采用3種溶劑(高水相、高有機(jī)相、低pH)提取藥渣中代謝物，2種色譜（反向、親水）模式保留后分離，正、負(fù)電離（ESI±）模式電離，高分辨質(zhì)譜在m/z:50-1200Da范圍內(nèi)檢測(cè)代謝物組，發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)藥渣中含有鏈霉胍和鏈霉素2種化合物。通過危害分析，發(fā)現(xiàn)鏈霉胍和鏈霉素存在動(dòng)

3、物食品蓄積毒性和誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥風(fēng)險(xiǎn)。因此，將其確定為鏈霉素藥渣危害因子。
　　2.將鏈霉胍、鏈霉素作為鏈霉素藥渣特征標(biāo)志物，建立了飼料中鏈霉素藥渣確證分析方法。該方法以20％TCA溶液為提取溶劑，采用Na2EDTA消除基質(zhì)中金屬離子干擾，通過弱陽(yáng)離子交換固相萃取(WCX)方式凈化、富集目標(biāo)化合物，利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)正離子(ESI+)電離、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式檢測(cè)2種特征標(biāo)志物。方法準(zhǔn)確性（鏈霉素:

4、71％-78％,鏈霉胍:75％-84％）、精密度(5.4％-9.6％)、線性范圍（50-1000μg/kg范圍內(nèi)R2≥0.99）、LODs(20μg/kg)、LOQs（50μg/kg）等性能指標(biāo)能夠滿足飼料中鏈霉素藥渣確證分析要求。
　　3.鏈霉素藥渣危害因子誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥性風(fēng)險(xiǎn)分析。以大腸桿菌（E.Coli）、沙門氏菌(Salmonella)為受試菌，鏈霉胍、鏈霉素為誘導(dǎo)因子，開展了體外誘導(dǎo)耐藥性風(fēng)險(xiǎn)分析。結(jié)果表明，鏈霉素能夠誘導(dǎo)

5、2種受試菌產(chǎn)生耐藥性;鏈霉胍不能誘導(dǎo)2種受試菌產(chǎn)生鏈霉素耐藥性，但是與鏈霉素同時(shí)存在條件下對(duì)E.Coli具有協(xié)同誘導(dǎo)耐藥的作用。該結(jié)果從體外實(shí)驗(yàn)的角度表明鏈霉素藥渣危害因子存在誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)，并且大于相同濃度鏈霉素的誘導(dǎo)耐藥風(fēng)險(xiǎn)。
　　4.采用非靶向代謝組學(xué)方法研究鏈霉素、鏈霉胍誘導(dǎo)E.Coli耐藥機(jī)制。建立了E.Coli代謝組學(xué)樣品前處理方法，即低溫生理鹽水熔滅，冷凍研磨-超聲裂解細(xì)胞、冷甲醇-水(50/50, v/v

6、)提取代謝物組。采用該方法對(duì)鏈霉素耐藥E.Coli進(jìn)行樣品前處理，通過UPLC-QTOF對(duì)代謝物進(jìn)行分離和測(cè)定，經(jīng)PCA、OPLS-DA分析以及Chemspider等在線數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)方式篩選、鑒定出不同誘導(dǎo)方式誘導(dǎo)獲得的耐藥菌株與敏感菌株差異代謝物22種。經(jīng)過KEGG代謝通路分析和MetaboAnalyst代謝通路拓?fù)浞治?，發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽代謝、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸降解、丙酮酸代謝、丁酸代謝、脂肪酸代謝、丙酸酯代謝、泛酸和輔酶A生物合成、