基于石墨烯熒光淬滅作用的DNA甲基化及生物小分子分析方法的研究.pdf

1、隨著醫(yī)療技術(shù)的提高，癌癥等惡性疾病的死亡率逐漸降低，癌癥等不再是不治之癥。而實(shí)現(xiàn)各種疾病的早期診斷和治療則是提高疾病患者生存率的關(guān)鍵。通過(guò)對(duì)基因與癌癥等基因相關(guān)的疾病的了解，從分子水平分析實(shí)現(xiàn)對(duì)各類疾病的早期診斷與治療具有重要的意義。熒光分析法是一種常用的分析檢測(cè)方法，具有靈敏度高、選擇性好、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。而各類熒光材料（如石墨烯和石墨烯量子點(diǎn)）的發(fā)展使熒光傳感器檢測(cè)手段、檢測(cè)效果、應(yīng)用領(lǐng)域得到了顯著的提高和拓展。本文旨在基于石墨烯類

2、材料特殊的熒光性能實(shí)現(xiàn)疾病DNA和生物小分子的熒光分析，為某些疾病的早期診斷和治療觀察提供快速、靈敏、精確的方法。本論文主要以DNA甲基化、去甲基化引起的惡性疾病基因和高鐵血紅素為研究對(duì)象，實(shí)現(xiàn)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化的分析以及高鐵血紅素的熒光分析方法。主要內(nèi)容如下:
　　1、我們建立了一種基于氧化石墨烯熒光淬滅作用的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的分析方法。該方法中使用了一種包括與GO作用的結(jié)合區(qū)域和與目標(biāo)DNA雜交的感應(yīng)區(qū)域的特殊單鏈

3、DNA探針。單鏈探針吸附于GO表面，與目標(biāo)DNA雜交經(jīng)限制性內(nèi)切酶HpaⅡ剪切后，F(xiàn)AM離開(kāi)GO表面進(jìn)入溶液，熒光信號(hào)恢復(fù)。然而，雙鏈被M.SssⅠ甲基化后HpaⅡ無(wú)法剪切，熒光信號(hào)無(wú)明顯恢復(fù)且熒光信號(hào)恢復(fù)程度與M.SssⅠ濃度有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)AM的熒光強(qiáng)度變化值與M.SssⅠ濃度對(duì)數(shù)值在0.1 U/mL到100 U/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，信噪比為3時(shí)最低檢測(cè)限為（0.03±0.01）U/mL。并且，該方法能靈敏地識(shí)別其它

4、甲基轉(zhuǎn)移酶，具有良好的選擇性。該方法可避免由于非特異性吸附干擾物而產(chǎn)生虛假信號(hào)，且能有效用于MTase抑制劑的評(píng)估和篩選，有望用于抗癌藥物的發(fā)現(xiàn)。
　　2、我們發(fā)展了一種基于MBD2去甲基酶和限制性內(nèi)切酶HpaⅡ相互作用體系來(lái)檢測(cè)特定CpG位點(diǎn)的DNA去甲基化，并且建立一種基于氧化石墨烯熒光淬滅作用分析MBD2的方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:MBD2檢測(cè)范圍可達(dá)到0.2-300ng/mL，最低檢測(cè)限是（0.05±0.01）ng/mL(S/N

5、=3)。該方法對(duì)MBD2活性分析具有良好的靈敏性和選擇性，并可用于復(fù)雜體系對(duì)DNA去甲基酶的檢測(cè)，有望成為檢測(cè)DNA去甲基水平的重要傳感方法，對(duì)生物醫(yī)學(xué)研究和早期臨床診斷等具有重要的參考價(jià)值。
　　3、我們通過(guò)電化學(xué)方法合成硼摻雜石墨烯量子點(diǎn)(BGQDs)，并成功將其應(yīng)用于高鐵血紅素(Hematin)的檢測(cè)。根據(jù)高鐵血紅素對(duì)BGQDs的高效熒光淬滅能力，可直接分析人類紅細(xì)胞中高鐵血紅素含量。其創(chuàng)新性在于本方法不僅可以實(shí)現(xiàn)高鐵血紅素

6、的高靈敏、高選擇性分析，而且本方法可直接分析紅細(xì)胞中高鐵血紅素含量，避免了其它方法必須先分離血紅蛋白等操作。在0.01-0.92μmol/L范圍內(nèi)，高鐵血紅素濃度和熒光強(qiáng)度具有良好的線性關(guān)系，其最低檢測(cè)限為（0.005±0.001）μmol/L(S/N=3)。此外，本方法可用于健康型和鐮刀型紅細(xì)胞中高鐵血紅素含量的分析。結(jié)果表明，健康型和鐮刀型紅細(xì)胞中高鐵血紅素濃度分別是（23.1±4.9）μmol/L和（52.5土9.5）μmol/L