基于金納米材料介導(dǎo)電致化學(xué)發(fā)光的蛋白激酶檢測(cè)研究.pdf

1、作為一門新興的分析方法，近年來(lái)電致化學(xué)發(fā)光（ECL）受到了越來(lái)越多的關(guān)注，而新材料的開(kāi)發(fā)在ECL發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了非常重要的作用。納米材料具有獨(dú)特的光電性能、比表面積大以及良好的生物相容性，已在ECL生物傳感領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。蛋白激酶調(diào)控的磷酸化作用與許多生命活動(dòng)密切相關(guān)，而蛋白激酶的異常表達(dá)更會(huì)導(dǎo)致多種疾病及癌癥的發(fā)生，因此精確分析激酶活性及篩選相關(guān)激酶抑制劑對(duì)于疾病診斷和臨床治療具有十分重要的意義。本論文制備了多種納米材料，利用這些納

2、米材料的光電性質(zhì)構(gòu)建新型ECL生物傳感器，并用于檢測(cè)蛋白激酶活性以及篩選激酶抑制劑，主要分為以下三部分工作：
　　1.首先，介紹了電致化學(xué)發(fā)光的定義、特點(diǎn)以及發(fā)光試劑的分類，電化學(xué)發(fā)光作為一種與電化學(xué)技術(shù)有關(guān)的光學(xué)分析方法，兼具電化學(xué)分析和光學(xué)分析的特點(diǎn)。隨后，概述了金屬納米材料和碳氮化合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)及其在電化學(xué)發(fā)光領(lǐng)域中的應(yīng)用。最后，綜述了蛋白質(zhì)磷酸化反應(yīng)和蛋白激酶的作用，蛋白激酶作為參與細(xì)胞活動(dòng)的重要激酶，其活性的異常將導(dǎo)致

3、多種疾病的發(fā)生，在激酶活性的眾多檢測(cè)方法中，基于納米材料的ECL分析方法具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。
　　2.利用Au NCs對(duì)g-C3N4的ECL信號(hào)的增強(qiáng)效應(yīng)，構(gòu)建了一種免標(biāo)記、高靈敏且操作簡(jiǎn)單的新型生物傳感器用于檢測(cè)蛋白激酶A（PKA）的活性。首先將g-C3N4溶液滴涂于玻碳電極（GCE）表面并晾干，再滴涂一層殼聚糖（CS），在EDC和NHS作用下多肽與CS發(fā)生酰胺反應(yīng)而偶聯(lián)到CS/g-C3N4/GCE上；在PKA和巰基三磷酸腺苷（ATP

4、-s）的作用下，多肽的絲氨酸位點(diǎn)發(fā)生磷酸化反應(yīng)，從而將巰基磷酸根轉(zhuǎn)移到多肽/CS/g-C3N4/GCE上；進(jìn)而通過(guò)Au-S作用將Au NCs捕獲于巰基磷酸化多肽修飾電極表面，使得g-C3N4的ECL信號(hào)大大增強(qiáng)。隨著PKA濃度的增加，捕獲到電極表面的Au NCs增多，對(duì)g-C3N4的ECL增強(qiáng)效應(yīng)越顯著，g-C3N4的ECL增強(qiáng)程度與PKA濃度呈正相關(guān)，據(jù)此可實(shí)現(xiàn)對(duì)PKA活性的高靈敏和選擇性檢測(cè)。此外，比較了多肽鏈長(zhǎng)度以及可發(fā)生磷酸化的

5、絲氨酸位置對(duì)g-C3N4的ECL強(qiáng)度的影響，結(jié)果表明，隨著多肽鏈長(zhǎng)度的增加以及磷酸化位點(diǎn)距離電極表面距離的增加，Au NCs對(duì)g-C3N4的ECL增強(qiáng)效應(yīng)減弱，可見(jiàn)Au NCs對(duì)g-C3N4的ECL增強(qiáng)效應(yīng)與二者之間的距離有關(guān)。本方法構(gòu)建的ECL傳感器還可用于對(duì)激酶抑制劑的篩選以及對(duì)MCF-7細(xì)胞溶解產(chǎn)物等復(fù)雜生物環(huán)境中PKA活性的靈敏檢測(cè)。
　　3.基于 g-C3N4和 Au NPs之間的共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)（RET）構(gòu)建新型 EC

6、L生物傳感器并用于檢測(cè)PKA活性。以S2O82-為共反應(yīng)劑時(shí)，g-C3N4修飾電極能夠產(chǎn)生強(qiáng)的陰極ECL信號(hào)；將多肽組裝到g-C3N4修飾電極表面，在PKA和ATP-s的作用下，多肽發(fā)生巰基磷酸化，進(jìn)而通過(guò)Au-S鍵將Au NPs捕獲到多肽的巰基磷酸化位點(diǎn)上，拉近了Au NPs與g-C3N4之間的距離，且g-C3N4的ECL發(fā)射光譜和Au NPs的吸收光譜部分重疊，使得g-C3N4能夠?qū)⒛芰哭D(zhuǎn)移給Au NPs， g-C3N4的ECL強(qiáng)度