骨化三醇抑制單核細(xì)胞促纖維化作用分子機(jī)制的研究.pdf

1、目的：通過觀察骨化三醇對THP－1細(xì)胞MCP－1、CCR2、MMP－9、TIMP－1 mRNA和蛋白水平表達(dá)的影響，從單核細(xì)胞角度探討骨化三醇對腎間質(zhì)纖維化的抑制作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.MTT法測定脂多糖(LPS)、貝那普利對THP－1細(xì)胞增殖作用的影響，摸索最佳作用劑量：(1)根據(jù)LPS終濃度設(shè)定0.01μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml，20μg/ml五個(gè)分(亞)組，并設(shè)一個(gè)空白對

2、照組，加入等量的D－Hank’s液；(2)根據(jù)貝那普利終濃度設(shè)定0.1μg/μl，0.5μg/μl，1μg/μl，5μg/μl，10μg/μl，50μg/μl六個(gè)分組，并設(shè)定一個(gè)空白對照組，加入等量的D-Hank’s液，用酶標(biāo)儀在570nm波長處測定各組樣品的吸光值(A570)。
　　 2.RT-PCR、western blot法測定骨化三醇對THP－1細(xì)胞MCP－1、CCR2、MMP－9、TIMP－1 mRNA和蛋白水平表達(dá)的

3、影響
　　 實(shí)驗(yàn)共分為6組：①骨化三醇高劑量組(終濃度為10-6mol/L)；②骨化三醇中劑量組(終濃度為10-7mol/L)；③骨化三醇低劑量組(終濃度為10-8mol/L)；④陽性對照組(貝那普利)；⑤LPS刺激組；⑥空白對照組。取對數(shù)生長期細(xì)胞，D－Hank’s液洗滌，接種于含有LPS的20％胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h，D－Hank’s液洗滌，接種于含2％胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基的6孔板中，培養(yǎng)24

4、h，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)藥物，培養(yǎng)24h后，用RT-PCR和western blot法測定細(xì)胞中MCP-1、CCR2、MMP-9、TIMP-1 mRNA和蛋白的相對含量。數(shù)據(jù)資料用(x-±SD)表示。
　　 結(jié)果：
　　 1.不同濃度LPS、貝那普利對THP-1細(xì)胞增殖的影響(MTT)
　　 當(dāng)LPS終濃度升至10μg/ml(0.177±0.009)，細(xì)胞生長明顯受抑制，與空白對照組(0.261±0.025)相比

5、，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；當(dāng)貝那普利終濃度升高到50μg/μl(0.129±0.005)時(shí)，THP-1細(xì)胞的生長明顯受抑制，與空白對照組(0.221±0.011)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 2.骨化三醇對經(jīng)LPS誘導(dǎo)的THP－1細(xì)胞MCP－1、CCR2、MMP－9、TIMP－1 mRNA表達(dá)的影響
　　 經(jīng)LPS刺激24h后，THP－1細(xì)胞中MCP－1、CCR2、MMP-9、TIMP－1mR

6、NA的表達(dá)量均明顯升高，與空白對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)過不同劑量骨化三醇作用24h之后，THP－1細(xì)胞MCP－1、CCR2、TIMP－1 mRNA的表達(dá)量受到抑制，骨化三醇高劑量組與LPS刺激組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中MCP－1、TIMP-1 mRNA的表達(dá)與骨化三醇有劑量依賴關(guān)系。而CCR2 mRNA的表達(dá)與骨化三醇無劑量依賴關(guān)系；而MMP-9 mRNA的表達(dá)較LPS刺激組有所升高，且骨化

7、三醇中劑量組與LPS刺激組相比，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，MMP-9 mRNA的表達(dá)與骨化三醇無劑量依賴關(guān)系；空白對照組中MCP-1、CCR2、MMP-9、TIMP-1 mRNA均有基礎(chǔ)量表達(dá)。
　　 3.骨化三醇對經(jīng)LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞MCP-1、CCR2、MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)的影響
　　 經(jīng)LPS刺激24h后，THP-1細(xì)胞中MCP-1、CCR2、MMP-9、TIMP-1蛋白的表達(dá)量

8、均明顯升高，與空白對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)過不同劑量骨化三醇作用24h之后，MCP-1、CCR2、TIMP-1蛋白的表達(dá)量受到抑制，與LPS刺激組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而MMP-9蛋白的表達(dá)較LPS刺激組有所升高，且這種差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；空白對照組中MCP-1、CCR2、MMP-9、TIMP-1蛋白均有基礎(chǔ)量表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1.骨化三醇可以使活化的