基于FRET機(jī)理的pH熒光探針的設(shè)計合成及真菌細(xì)胞pHi成像.pdf

1、細(xì)胞內(nèi)pH(intracellular pH，pHi)和pH穩(wěn)態(tài)對參與控制真核細(xì)胞的生長和代謝極為重要。真菌細(xì)胞的pHi影響真菌細(xì)胞膜的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝酶的活性和生物大分子的合成，同時也是一些其它一些細(xì)胞反應(yīng)的觸發(fā)器，如誘使熱敏蛋白的產(chǎn)生。一些具有抗真菌活性的藥物如質(zhì)子泵抑制劑奧美拉唑、抗心律失常藥胺碘酮的作用機(jī)理也與降低真菌細(xì)胞pHi改變有關(guān)。準(zhǔn)確測定真菌細(xì)胞的pHi有利于研究真菌細(xì)胞pHi調(diào)控系統(tǒng)，和pHi相關(guān)的藥物作用機(jī)制。目前常用

2、的測定真菌細(xì)胞內(nèi)pH的方法主要有pH敏感的小分子參比熒光探針和pH敏感的參比熒光蛋白。參比熒光蛋白雖然具有非侵襲性的優(yōu)點(diǎn)，但操作復(fù)雜耗時，在此不做深究。小分子熒光探針技術(shù)操作方便快捷，靈敏度高，但目前應(yīng)用于真菌細(xì)胞的小分子熒光探針較少，且大都為商品化的染料。小分子自身也存在一些局限性:1.不容易透過真菌的細(xì)胞膜，需要做成非熒光形式的二乙?；ヮ惙肿舆M(jìn)入細(xì)胞后再由酶水解得到熒光核，而且有些染料分子在細(xì)胞內(nèi)水解不完全，影響在細(xì)胞內(nèi)的成像;2

3、.某些染料分子的pKa偏高，并不適合真菌細(xì)胞pHi的成像和測定。本文的研究目的是設(shè)計合成新型的pH敏感的小分子熒光探針用于真菌細(xì)胞pHi測定和成像。
　　硼酯螺環(huán)可逆開關(guān)控制的熒光團(tuán)R-B為本文課題組前期合成得到的pH敏感的小分子熒光探針，其結(jié)構(gòu)和機(jī)理新穎，但其pKa為9.46，并不適合真菌細(xì)胞生理學(xué)范圍內(nèi)的pHi測定與成像。為了改善pKa和光譜性質(zhì)，我們考慮將熒光團(tuán)R-B作衍生化處理，設(shè)計成一個基于FRET機(jī)理的參比型熒光探針。

4、即將pH敏感的硼酯螺環(huán)母體結(jié)構(gòu)作為能量受體分子，香豆素?zé)晒夂藶槟芰抗w分子，剛性的哌啶環(huán)為中間連接體，設(shè)計合成得到了基于FRET機(jī)理的第三代pH敏感的小分子熒光探針R-BC。通過光譜性質(zhì)測定，我們得到R-BC的pKa為6.25，比較符合測定真菌細(xì)胞pHi及酸化的pKa要求。同時該探針對H+的傳感具有良好的可逆性和專一性。通過探針應(yīng)用于真菌細(xì)胞，R-BC細(xì)胞膜通透性高、細(xì)胞毒性小，具有良好的真菌細(xì)胞生物相容性。經(jīng)過真菌細(xì)胞原位校正，R-B

5、C的兩波段的熒光強(qiáng)度比Ired/Iblue在pHi為5.0到8.0范圍內(nèi)與pHi成良好的線性相關(guān)，能準(zhǔn)確測定此范圍內(nèi)的pHi。我們利用該探針測定了抗心率失常藥胺碘酮對于受試白色念珠菌的pHi的影響，發(fā)現(xiàn)胺碘酮同樣能引起白色念珠菌的pHi酸化，證明了胺碘酮發(fā)揮抗菌活性的部分作用機(jī)制與影響真菌細(xì)胞的pHi有關(guān)。
　　同時我們設(shè)計合成了哌啶端分別連有乙?；拖愣顾匾阴；呐瘐ヂ莪h(huán)探針分子R-BN-1和R-BC-1。通過光譜性質(zhì)測定和比較

6、其pKa，初步研究和探討了結(jié)構(gòu)修飾對硼酯螺環(huán)熒光核pKa的影響。結(jié)果表明接入的香豆素?zé)晒夂四艽偈够衔锓肿拥膒Ka向酸性區(qū)域移動，中間增加一個亞甲基連接單位能使pKa繼續(xù)向酸性區(qū)域移動，但由于兩熒光團(tuán)間隔距離增加及連接體剛性程度減弱，相應(yīng)的FRET效能降低。
　　基于FRET機(jī)理的小分子熒光探針目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于哺乳動物細(xì)胞，但還未有報道涉及到真菌細(xì)胞尤其是臨床上致病真菌的應(yīng)用。本文設(shè)計合成了新穎的FRET型的小分子熒光探針R-B