p5 3在周期性張應(yīng)力誘導(dǎo)的成肌細(xì)胞凋亡中的作用及機制.pdf

1、目的：
　　本研究通過構(gòu)建成肌細(xì)胞體外培養(yǎng)-力學(xué)刺激模型，對細(xì)胞施以適當(dāng)?shù)闹芷谛詮垜?yīng)力，觀察應(yīng)力刺激對成肌細(xì)胞體外生長的影響，研究p53在應(yīng)力誘導(dǎo)的成肌細(xì)胞凋亡中的作用并初步探討p53發(fā)揮作用的機制，為闡明面頜肌適應(yīng)性改建的微觀調(diào)控機制，為功能矯形治療在臨床中的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。
　　方法：
　　選取L6大鼠成肌細(xì)胞為研究對象，實驗分為對照組和加力組。在成功構(gòu)建成肌細(xì)胞體外培養(yǎng)－力學(xué)刺激模型的基礎(chǔ)上，對加力組細(xì)胞分別施

2、加2h、6h、12h、24h的周期性張應(yīng)力，加載頻率為10 cycles/min，拉伸幅度為15%的細(xì)胞形變，對照組不加力。利用倒置相差顯微鏡觀察成肌細(xì)胞體外生長及其在應(yīng)力作用下的變化，利用DAPI熒光染色從形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞凋亡情況，應(yīng)用Western Blot技術(shù)從蛋白水平檢測p53與Cyt-c的表達(dá)變化，用Caspase-9活性檢測試劑盒檢測Caspase-9在不同時間應(yīng)力刺激下的活性表達(dá)，應(yīng)用p53抑制劑（Pifithrin-α，P

3、FT-α）進(jìn)一步明確p53在細(xì)胞凋亡中的作用，并通過分離細(xì)胞線粒體，分別檢測線粒體內(nèi)外p53的蛋白表達(dá)，深入探討p53參與調(diào)控細(xì)胞凋亡的可能機制。采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1.倒置相差顯微鏡下可見成肌細(xì)胞在體外合適的環(huán)境中，表現(xiàn)出較好的增殖能力。
　　2.給細(xì)胞施加10cycle/min，拉伸幅度為15%細(xì)胞形變的周期性張應(yīng)力，觀察到成肌細(xì)胞的排列會隨應(yīng)力刺激發(fā)生適應(yīng)性調(diào)整

4、。
　　3. DAPI染色結(jié)果表明，應(yīng)力可以刺激成肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，且在一定時間內(nèi)，凋亡率隨加力時間的延長而增加。
　　4. Western Blot檢測結(jié)果顯示p53和Cyt-c的蛋白表達(dá)隨著加力時間的延長而升高，用p53抑制劑處理后加力24h與單純加力24h組相比，p53和Cyt-c的表達(dá)均有所下降，但仍高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　5. Caspase-9活性檢測試劑盒檢測到Caspase-9

5、的活性隨加力時間延長而表達(dá)增強，用p53抑制劑處理后加力24h與單純加力24h組相比，其表達(dá)活性有所下降，但仍高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　6.提取細(xì)胞線粒體后，用Western Blot分別檢測線粒體內(nèi)外的p53蛋白表達(dá)，結(jié)果表明，線粒體 p53的表達(dá)隨時間延長不斷升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而剩余細(xì)胞成分中p53的表達(dá)變化無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.10cycle/min，