ATF6在應(yīng)力介導(dǎo)的成肌細(xì)胞凋亡與自噬中的作用及機(jī)制.pdf

1、目的：功能矯形作為青少年時(shí)期錯(cuò)頜畸形主要治療手段，通過(guò)引發(fā)口腔頜面部軟組織發(fā)生適應(yīng)性改建以達(dá)到矯治的目的。本實(shí)驗(yàn)從微觀層面上著手，探討周期性張應(yīng)力作用于成肌細(xì)胞產(chǎn)生的影響，并通過(guò)研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子ATF6在該過(guò)程的作用及其機(jī)制，進(jìn)一步闡明功能矯形作用機(jī)制為臨床治療提供理論依據(jù)。
　　方法：成功構(gòu)建大鼠L6成肌細(xì)胞的體外-力學(xué)刺激模型，細(xì)胞應(yīng)用頻率為10cycles/min，拉伸變形率為15％的應(yīng)力分別加載0h、2h、6h、12

2、h和24h，所有組的細(xì)胞應(yīng)在相同條件下培養(yǎng)。應(yīng)用DAPI熒光染色觀察細(xì)胞在不同應(yīng)力加載時(shí)間其凋亡的情況；應(yīng)用Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)照組、各加力組以及加入3-MA抑制劑后不加力和加力24h的成肌細(xì)胞凋亡率；應(yīng)用Western blot檢測(cè)LC3和p62的蛋白表達(dá)水平，并聯(lián)合應(yīng)用3-MA抑制劑檢測(cè)應(yīng)力對(duì)LC3和p62的蛋白表達(dá)水平影響；采用Real Time PCR檢測(cè)ATF6的干擾效率，并分別檢測(cè)siRNA干擾

3、ATF6前后的Bcl-2、Bax和Beclin1 mRNA的表達(dá)變化；應(yīng)用Western blot檢測(cè)siRNA干擾ATF6前后的Bcl-2、Bax和Beclin1蛋白表達(dá)水平的變化，以明確ATF6在應(yīng)力介導(dǎo)成肌細(xì)胞凋亡和自噬中的作用及機(jī)制，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用SPSS17.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：
　　1.DAPI染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn)，周期性張應(yīng)力可誘導(dǎo)成肌細(xì)胞凋亡，隨應(yīng)力加載時(shí)間的延長(zhǎng)凋亡率呈上升，

4、且在24h達(dá)13.36±0.5%。
　　2.經(jīng)RT-PCR結(jié)果顯示：隨應(yīng)力加載時(shí)間的延長(zhǎng)Bcl-2的mRNA表達(dá)量在加力2h開(kāi)始逐漸下降，并在24h達(dá)最低值，而B(niǎo)ax的mRNA的表達(dá)量則與應(yīng)力加載的時(shí)間呈現(xiàn)正相關(guān)的趨勢(shì)；Western blot檢測(cè)，Bcl-2/Bax的相對(duì)濃度與應(yīng)力加載時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　3.Western blot結(jié)果顯示：LC3II/I相對(duì)蛋白表達(dá)水平和Beclin1的

5、蛋白表達(dá)水平隨著應(yīng)力加載時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，而p62的蛋白在應(yīng)力加載2h開(kāi)始呈現(xiàn)逐漸遞減的趨勢(shì)，p<0.05。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)3-MA抑制劑組的細(xì)胞凋亡率明顯高于24h組，15.75±0.35%vs13.36±0.5%，p<0.05。
　　5.成功干擾成肌細(xì)胞內(nèi)的ATF6后，RT-PCR結(jié)果顯示：Bax和Beclin1表達(dá)量相對(duì)于24h組均明顯減少；而B(niǎo)cl-2的表達(dá)量有明顯上升的趨勢(shì)，p<0.05。Wester

6、n blot結(jié)果顯示Bcl-2/Bax相對(duì)蛋白表達(dá)水平干擾組的高于與24h組，但是仍低于對(duì)照組的表達(dá)量；Beclin1的蛋白表達(dá)水平低于24h組的，p<0.05。
　　結(jié)論：
　　1.在細(xì)胞拉伸為15%幅度，10cycles/min的頻率的周期性張應(yīng)力刺激下成肌細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬；
　　2.應(yīng)力加載的時(shí)間與成肌細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)相關(guān)性，隨應(yīng)力加載時(shí)間的延長(zhǎng)凋亡率逐漸升高；
　　3.成肌細(xì)胞自噬的強(qiáng)度與應(yīng)力加載的時(shí)間呈正