來源于Yersinia kristensenii的新型植酸酶基因YkAPPAS在畢赤酵母中的表達研究及其酶學特性分析.pdf

1、通常情況下，糧食中的肌醇和磷大多以植酸的狀態(tài)存在。以植酸鹽狀態(tài)存在的有機磷酸化合物被稱為植酸磷。動物要吸收飼料中以植酸磷狀態(tài)存在的磷，只有將植酸磷催化成無機磷酸鹽的形式。
　　植酸酶屬磷酸單酯水解酶，是最近幾年出現的一種新型綠色添加劑，它通過催化過程，將植酸以及植酸鹽催化成磷酸（或鹽）和肌醇。有很多實驗研究證明，使用植酸酶作為飼料添加劑時，磷的吸收率可被提高，無機磷的補充量被減少，同時動物糞便中無機磷的比重也下降；在飼料中植酸酶的

2、加入能有效的抑制機體內的植酸與金屬離子和蛋白質生成絡合物，提高多種微量元素和蛋白質的利用率。
　　天然來源的植酸酶普遍存在表達水平低、提取困難、成本高等問題，這些問題都導致其難以滿足現實生產的需要。所以構建基因工程菌作為微型生物反應器來實現異源高水平分泌表達，成為解決這一問題的關鍵。通過基因工程手段能夠解決天然植酸酶分泌量低及抗逆性和熱穩(wěn)定性差等問題。利用巴斯德畢赤酵母作為生物反應器誘導重組植酸酶表達的方法是最具有優(yōu)勢的，該方法操

3、作簡便、表達量大且適宜工業(yè)化生產。
　　憑借微生物工程技術的不斷發(fā)展，對植酸酶結構和功能的探索正逐漸的成熟與深化。本文對來源于Yersinia kristensenii的植酸酶基因YkAPPA進行改造，并成功實現了在大腸桿菌（Escherichia coli）EG60和畢赤酵母（Pichia pastoris）GS-115中異源表達，同時對其重組植酸酶相關酶學特性和動力學參數等進行了研究分析，主要研究結果如下：
　　1.利用

4、NCBI數據庫公布的來源于Yersinia kristensenii（基因登錄號為JQ394763.1）的植酸酶基因序列，按照畢赤酵母的密碼子偏愛性對目的基因進行優(yōu)化，優(yōu)化前與優(yōu)化后的氨基酸序列完全一致。設計合成長度為60bp的小片段引物序列，利用 PTDS基因合成技術合成了新的重組植酸酶基因 YkAPPAS，重組植酸酶基因全長為1266bp，依據密碼子偏好性將 GC含量調整至51.9％。本實驗獲得的植酸酶YkAPPAS經過對比后發(fā)現，

5、其氨基酸序列中含有植酸酶的最具保守的兩個區(qū)域：分別是與植酸酶底物結合位點RHG×R×P和酶的催化中心HD。將合成的目的基因與pMD18-T載體連接克隆及測序，隨后將測序成功的目的基因與表達載體相連，合成pYPX88-YkAPPAS載體。利用電擊法將載體導入酵母GS-115中，篩選具有高活性的轉化株，用終濃度為1%的甲醇誘導培養(yǎng)，發(fā)酵上清液中酶的分泌量可達到106.73μg/mL，完成了重組植酸酶YkAPPAS在畢赤酵母中的高活性、高產量

6、的表達。在重組植酸酶YkAPPAS基因的5’端添加了6個His標記，所以利用硫酸銨分級沉淀法進行蛋白的初步純化后再利用Ni離子親和層析分離出單一的植酸酶重組蛋白。聚丙烯酰氨凝膠電泳結果顯示，重組植酸酶YkAPPAS的蛋白分子量約為46kDa，實際結果與生物信息學預測理論值一致，說明YkAPPAS幾乎沒有糖基化現象的發(fā)生。
　　2.將純化后的重組植酸酶進行酶學特性分析，研究結果顯示，其最適pH分別是pH4.5和pH6，pH3-pH1