來(lái)源于Yersinia kristensenii的新型植酸酶基因YkAPPAS在畢赤酵母中的表達(dá)研究及其酶學(xué)特性分析.pdf

1、通常情況下，糧食中的肌醇和磷大多以植酸的狀態(tài)存在。以植酸鹽狀態(tài)存在的有機(jī)磷酸化合物被稱(chēng)為植酸磷。動(dòng)物要吸收飼料中以植酸磷狀態(tài)存在的磷，只有將植酸磷催化成無(wú)機(jī)磷酸鹽的形式。
　　植酸酶屬磷酸單酯水解酶，是最近幾年出現(xiàn)的一種新型綠色添加劑，它通過(guò)催化過(guò)程，將植酸以及植酸鹽催化成磷酸（或鹽）和肌醇。有很多實(shí)驗(yàn)研究證明，使用植酸酶作為飼料添加劑時(shí)，磷的吸收率可被提高，無(wú)機(jī)磷的補(bǔ)充量被減少，同時(shí)動(dòng)物糞便中無(wú)機(jī)磷的比重也下降；在飼料中植酸酶的

2、加入能有效的抑制機(jī)體內(nèi)的植酸與金屬離子和蛋白質(zhì)生成絡(luò)合物，提高多種微量元素和蛋白質(zhì)的利用率。
　　天然來(lái)源的植酸酶普遍存在表達(dá)水平低、提取困難、成本高等問(wèn)題，這些問(wèn)題都導(dǎo)致其難以滿(mǎn)足現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)的需要。所以構(gòu)建基因工程菌作為微型生物反應(yīng)器來(lái)實(shí)現(xiàn)異源高水平分泌表達(dá)，成為解決這一問(wèn)題的關(guān)鍵。通過(guò)基因工程手段能夠解決天然植酸酶分泌量低及抗逆性和熱穩(wěn)定性差等問(wèn)題。利用巴斯德畢赤酵母作為生物反應(yīng)器誘導(dǎo)重組植酸酶表達(dá)的方法是最具有優(yōu)勢(shì)的，該方法操

3、作簡(jiǎn)便、表達(dá)量大且適宜工業(yè)化生產(chǎn)。
　　憑借微生物工程技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)植酸酶結(jié)構(gòu)和功能的探索正逐漸的成熟與深化。本文對(duì)來(lái)源于Yersinia kristensenii的植酸酶基因YkAPPA進(jìn)行改造，并成功實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌（Escherichia coli）EG60和畢赤酵母（Pichia pastoris）GS-115中異源表達(dá)，同時(shí)對(duì)其重組植酸酶相關(guān)酶學(xué)特性和動(dòng)力學(xué)參數(shù)等進(jìn)行了研究分析，主要研究結(jié)果如下：
　　1.利用

4、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)公布的來(lái)源于Yersinia kristensenii（基因登錄號(hào)為JQ394763.1）的植酸酶基因序列，按照畢赤酵母的密碼子偏愛(ài)性對(duì)目的基因進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化前與優(yōu)化后的氨基酸序列完全一致。設(shè)計(jì)合成長(zhǎng)度為60bp的小片段引物序列，利用 PTDS基因合成技術(shù)合成了新的重組植酸酶基因 YkAPPAS，重組植酸酶基因全長(zhǎng)為1266bp，依據(jù)密碼子偏好性將 GC含量調(diào)整至51.9％。本實(shí)驗(yàn)獲得的植酸酶YkAPPAS經(jīng)過(guò)對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，

5、其氨基酸序列中含有植酸酶的最具保守的兩個(gè)區(qū)域：分別是與植酸酶底物結(jié)合位點(diǎn)RHG×R×P和酶的催化中心HD。將合成的目的基因與pMD18-T載體連接克隆及測(cè)序，隨后將測(cè)序成功的目的基因與表達(dá)載體相連，合成pYPX88-YkAPPAS載體。利用電擊法將載體導(dǎo)入酵母GS-115中，篩選具有高活性的轉(zhuǎn)化株，用終濃度為1%的甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)，發(fā)酵上清液中酶的分泌量可達(dá)到106.73μg/mL，完成了重組植酸酶YkAPPAS在畢赤酵母中的高活性、高產(chǎn)量

6、的表達(dá)。在重組植酸酶YkAPPAS基因的5’端添加了6個(gè)His標(biāo)記，所以利用硫酸銨分級(jí)沉淀法進(jìn)行蛋白的初步純化后再利用Ni離子親和層析分離出單一的植酸酶重組蛋白。聚丙烯酰氨凝膠電泳結(jié)果顯示，重組植酸酶YkAPPAS的蛋白分子量約為46kDa，實(shí)際結(jié)果與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)理論值一致，說(shuō)明YkAPPAS幾乎沒(méi)有糖基化現(xiàn)象的發(fā)生。
　　2.將純化后的重組植酸酶進(jìn)行酶學(xué)特性分析，研究結(jié)果顯示，其最適pH分別是pH4.5和pH6，pH3-pH1