五種重要動物病毒快速恒溫擴增檢測技術的建立與應用.pdf

1、傳染病是引起全世界畜牧業(yè)經濟損失的最重要原因之一。羊口瘡病毒(Orf virus，ORFV)和羊痘病毒(Capripoxvirus，CaPV)是引起羊皮膚、粘膜皰疹和潰瘍的重要病毒；而豬圓環(huán)病毒Ⅱ型(Porcine circovims.type2，PCV2)、偽狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus，PRV)及細小病毒(Porcine parvovirus virus，PPV)則是引起豬繁殖障礙的重要病毒?？焖?、

2、簡單及特異性診斷在疫病防控中至關重要。重組酶聚合酶擴增(Recombinase polymerase amplification，RPA)是一種簡單、快速、敏感性高及特異性強的新型恒溫擴增技術，能在37-42℃恒溫條件下，20 min內完成檢測。本研究首次分別建立了快速檢測上述五種病毒的熒光探針和側流式免疫層析RPA檢測方法，并成功地應用于田間樣品檢測。具體研究結果如下:
　　1.分別建立了快速檢測 ORFV(ORFV real-

3、time RPA)、CaPV（CaPV real-time RPA）、PCV2(PCV2 real-time RPA)、PRV(PRV real-time RPA)及PPV（PPV real-time RPA）的熒光探針RPA方法，其靈敏度分別為100拷貝/反應、300拷貝/反應、100拷貝/反應、100拷貝/反應和300拷貝/反應，并均能特異性的檢測相應的病毒。利用上述建立的方法分別檢測相應的田間樣品，并與相對應的real-time

4、qPCR比較，檢出率分別為93％、94％、100％、93％及94％。
　　2.分別建立了快速檢測ORFV（ORFV RPA LFD）、CaPV(CaPVRPALFD)、PCV2(PCV2 RPALFD)、PRV（PRVRPA LFD）及PPV(PPV RPA LFD)的側流式免疫層析RPA方法，其靈敏度分別為80拷貝/反應、300 DNA拷貝/反應、100拷貝/反應、160拷貝/反應及400拷貝/反應，并均能特異性的檢測相應的病毒

5、。利用上述建立的方法分別檢測相應的田間樣品，并與相對應的real-time qPCR比較，檢出率分別為95％、97％、100％、93％及94％。
　　3.為了能同時檢測樣品中的ORFV和CaPV，建立了ORFV和CaPV雙重熒光探針RPA方法（duplex real-time RPA），其檢測ORFV和CaPV DNA的靈敏度分別為1000拷貝/反應和1200拷貝/反應。為了能同時檢測PCV2、PRV及PPV，建立了多重熒光探針R

6、PA(multiplx real-timeRPA)，其檢測PCV2、PRV及PPV靈敏度分別為10000拷貝/反應、1000拷貝/反應和1200拷貝/反應。該兩種方法均具有很好的特異性。
　　4.將基于磁珠的核酸提取方法與RPALFD方法聯用，以適用于臨床樣品的現場診斷。
　　研究結果表明，本文建立的RPA方法在ORFV, CaPV, PCV2，PRV和PPV的檢測上具有簡單，快速，敏感性高和特異性強的特點。該方法既可應用于