基于重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)的柯薩奇A6型病毒的快速檢測(cè)方法的建立.pdf

1、目的:
　　手足口病(HFMD，hand foot mouth disease)是全世界，尤其是在亞太地區(qū)流行的病毒性傳染病，主要感染5歲以下兒童，嚴(yán)重威脅兒童健康和生命。HFMD由多種病毒導(dǎo)致，主要包括腸道病毒71(EV71enterovirus71)型、柯薩奇病毒(CA，coxsakievirus)A16、A4、A6、A10、B3、B5以及艾克病毒30型等。近年來(lái)，多項(xiàng)研究表明HFMD的致病病原體譜發(fā)生改變，CA6成為越來(lái)越重

2、要的病原體，在全世界范圍內(nèi)已導(dǎo)致多起HFMD暴發(fā)。CA6可以引起重癥HFMD病例，并可導(dǎo)致部分重癥患兒死亡。CA6常引起非典型的HFMD，容易導(dǎo)致誤診。HFMD尚無(wú)有效治療藥物，針對(duì)EV71的CA16的單價(jià)以及雙價(jià)疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。但針對(duì)多種病毒的多價(jià)疫苗進(jìn)展緩慢。HFMD主要預(yù)防和控制措施是切斷傳播，對(duì)癥治療以減少并發(fā)癥的出現(xiàn)。加強(qiáng)HFMD的全球流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)監(jiān)測(cè)，預(yù)測(cè)新的暴發(fā)疫情將有助于HFMD的預(yù)防和控制，而病原體的

3、快速檢測(cè)則是HFMD有效監(jiān)測(cè)和診斷的關(guān)鍵。
　　重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(RPA，recombinase polymerase amplification)是英國(guó)Twist DX公司商業(yè)化的新型核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)不依賴于昂貴的儀器，在37-42度的恒溫條件下可完成對(duì)目的基因的擴(kuò)增和檢測(cè)，有多種探針可應(yīng)用于產(chǎn)物檢測(cè)，大大提高了檢測(cè)的特異性。另外，其擴(kuò)增產(chǎn)物也可以進(jìn)行測(cè)序分析，增加了其可核對(duì)性。RPA技術(shù)可以在20min內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)病原

4、體的檢測(cè)，是目前最快速的核酸擴(kuò)增檢測(cè)方法，已被廣泛用于病原體的快速檢測(cè)。所以，RPA技術(shù)非常適合于傳染病暴發(fā)現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。本研究旨在建立針對(duì)CA6的實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄一步法重組酶聚合酶(RT-RPA，reverse transcription remconbinase polymerase amplification)快速檢測(cè)方法。
　　方法:
　　在Genbank下載CA6病毒的VP1蛋白的基因序列，并比對(duì)序列尋找保守區(qū)。針

5、對(duì)保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性的引物，進(jìn)行引物篩選并設(shè)計(jì)相應(yīng)的探針，隨后建立針對(duì)CA6的實(shí)時(shí)熒光RT-RPA快速檢測(cè)方法。將含有目的片段的cDNA連接至載體，并進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，計(jì)算核酸濃度并轉(zhuǎn)換成拷貝數(shù)/μl，隨后進(jìn)行10倍梯度稀釋，每個(gè)梯度設(shè)置8個(gè)重復(fù)，分別用實(shí)時(shí)熒光RT-RPA檢測(cè)和商業(yè)化CA6熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，概率元分析計(jì)算其95％檢測(cè)限。用RT-RPA檢測(cè)對(duì)照病毒，分析其特異度。分別利用RT-RPA和商業(yè)化CA6熒光定量PCR檢測(cè)

6、試劑盒檢測(cè)234份EV71和CA16陰性的HFMD病例的糞便樣本，分析檢測(cè)結(jié)果一致性，計(jì)算Kappa值。
　　結(jié)果:
　　RT-RPA檢測(cè)方法的反應(yīng)時(shí)間為20min。RT-RPA檢測(cè)方法只與CA6發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生擴(kuò)增曲線，沒(méi)有與任何對(duì)照病毒發(fā)生反應(yīng)，其特異度為100％。RT-RPA的95％檢測(cè)限低至231拷貝/反應(yīng)，與商業(yè)化熒光定量PCR無(wú)差別。臨床樣本的檢測(cè)結(jié)果顯示RT-RPA檢測(cè)方法與商業(yè)化CA6熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒的