呋喃唑酮，呋喃妥因和加替沙星的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法的建立.pdf

1、隨著現(xiàn)代經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)近年來也迅速發(fā)展，由此引起的抗生素的濫用導(dǎo)致的大量藥物殘留已經(jīng)成為威脅人類健康的嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)社會(huì)問題。硝基呋喃類和氟喹諾酮類藥物是人工合成的廣譜抗生素，因?yàn)槠鋬r(jià)格低廉，效果良好，被廣泛應(yīng)用于畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。但是這些藥物的濫用也不可避免的導(dǎo)致大量殘留，對(duì)人體產(chǎn)生諸如致癌，致突變等毒副作用，引起細(xì)菌耐藥性的增加，還通過環(huán)境和食物鏈的作用間接對(duì)人體健康造成潛在危害?，F(xiàn)在很多國(guó)家已經(jīng)規(guī)定了食品中硝基呋喃類和氟喹諾

2、酮類藥物殘留的最高檢出上限。為保障人民身體健康和國(guó)家進(jìn)出口經(jīng)濟(jì)利益，建立方便快速可靠的硝基呋喃類和氟喹諾酮類藥物的殘留檢測(cè)方法是非常有必要的。 很多國(guó)家已經(jīng)為此而建立了一些藥物殘留的監(jiān)測(cè)方法。包括傳統(tǒng)的儀器法，微生物檢測(cè)法和新興的酶聯(lián)免疫檢測(cè)法（ELISA）。傳統(tǒng)檢測(cè)藥物殘留的儀器分析方法包括HPLC、LC-UV、IC-Ms和LC-MS-MS等。這些方法優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確、穩(wěn)定、特異性好，可以作為標(biāo)準(zhǔn)方法，但儀器設(shè)備昂貴，笨重，需要大量

3、的溶劑，對(duì)操作人員要求很高，樣品前處理復(fù)雜、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、不易普及，不適合對(duì)大規(guī)模的樣品進(jìn)行即時(shí)檢測(cè)。微生物檢測(cè)法雖然可以進(jìn)行大量樣品的即時(shí)檢測(cè)，但是特異性差，不能進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量分析。酶聯(lián)免疫檢測(cè)法（ELISA）克服了以上方法的缺點(diǎn)，是一種快速、靈敏、方便的檢測(cè)方法，可以用于大量樣品的即時(shí)檢測(cè)，有著廣闊的發(fā)展前景。而結(jié)合了化學(xué)發(fā)光分析的酶聯(lián)免疫檢測(cè)法（CL-ELISA），由于有著更高的靈敏度，更寬的線性范圍，成為了酶聯(lián)免疫檢測(cè)法的發(fā)展

4、趨勢(shì)。本論文旨在建立呋喃唑酮，呋喃妥因和加替沙星的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法（CL-ELISA）。 對(duì)于呋喃唑酮，根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，從其代謝產(chǎn)物（AOZ）出發(fā)制備免疫原和包被抗原。利用混合酸酐法合成的免疫原，先將AOZ先與CBA偶連，衍生為CPAOZ，然后利用混合酸酐法與活化的牛血清白蛋白（cBSA）偶聯(lián)合成了免疫原。將此免疫原免疫新西蘭大白兔制得呋喃唑酮的多克隆抗體。合成免疫原的同時(shí)，也利用戊二醛法將AOZ與卵清蛋白（OVA）偶

5、聯(lián)合成了包被抗原。對(duì)呋喃唑酮，其抗體用間接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光ELISA法檢測(cè)結(jié)果如下：IC50是0．8ng/mL，檢測(cè)限為0．01ng/mL。該抗體除對(duì)CPAOZ的交叉反應(yīng)率較高外，和其他藥物的交叉率均很小。而傳統(tǒng)的比色ELISA法得到的檢測(cè)下限為0．2ng/ml，IC50是2．9ng/mL，與傳統(tǒng)的比色ELISA法相比，化學(xué)發(fā)光ELISA法有著更好的靈敏度和檢測(cè)下限。用此抗體檢測(cè)呋喃唑酮在養(yǎng)殖用水中的添加回收率，批間回收率范圍在83-103

6、％之間，批內(nèi)回收率范圍在78-113％之間。批間變異系數(shù)在5-27％之間，批內(nèi)變異系數(shù)在4-18％之間。 對(duì)于呋喃妥因，其免疫原和包被抗原的合成方法與呋喃唑酮類似。也是從代謝產(chǎn)物AHD出發(fā)，衍生為CPAHD后，用混合酸酐法與活化的牛血清白蛋白（cBSA）偶聯(lián)合成了免疫原，免疫新西蘭大白兔制得多克隆抗體。用戊二醛法將AHD與卵清蛋白（OVA）偶聯(lián)合成包被抗原。對(duì)呋喃妥因，其抗體用間接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光ELISA法檢測(cè)結(jié)果如下：IC50為

7、0．85ng/mL，檢測(cè)限為0．01ng/mL，而傳統(tǒng)的比色ELISA法得到的檢測(cè)下限為0．1ng/ml，IC50是3．2ng/ml。該抗體除對(duì)CPAHD的交叉反應(yīng)比較明顯外，和其他藥物的交叉率均很小。用此抗體檢測(cè)呋喃妥因在養(yǎng)殖用水中的添加回收率，批間回收率范圍在93．2-110％之間，批內(nèi)回收率范圍在87．6-113．5％之間。批間變異系數(shù)在6-19％之間，批內(nèi)變異系數(shù)在3-16％之間。 對(duì)于加替沙星，其免疫原和包被抗原由ED

8、C法制備。其抗體用間接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光ELISA法檢測(cè)結(jié)果如下：IC50為0．4ng/mL，檢測(cè)限為0．01ng/mL，而傳統(tǒng)的比色ELISA法得到的檢測(cè)下限為0．05ng/ml，IC50是2．6ng/mL。該抗體與其他氟喹諾酮類藥物的交叉反應(yīng)均很小。用此抗體檢測(cè)加替沙星在牛奶樣品中的添加回收率，批間回收率范圍在93-103％之間，批內(nèi)回收率范圍在89-105％之間。批間變異系數(shù)在5-16％之間，批內(nèi)變異系數(shù)在4-10％之間。 通過