蘇丹紅酶聯(lián)免疫吸附檢測法的建立和初步應(yīng)用.pdf

1、蘇丹紅和對位紅是工業(yè)上普遍使用的兩種染料，均屬于親脂性偶氮小分子化合物。蘇丹紅主要可分為I、II、III和Ⅳ四種類型。蘇丹紅I號(hào)，又稱油溶黃，化學(xué)式為1-苯基偶氮-2-萘酚，分子式C16HI2N20，相對分子質(zhì)量248.28。對位紅，又稱對位苯胺紅，化學(xué)名稱為1-(4-硝基苯基偶氮)-2-萘酚，化學(xué)式CI6HIIN303，相對分子質(zhì)量293.28。對位紅與蘇丹紅I號(hào)的結(jié)構(gòu)極為相似，只是在苯基偶氮對位增加了一個(gè)硝基，主要染色原理和毒性也與

2、蘇丹紅I號(hào)相似。
　　 由于含偶氮結(jié)構(gòu)，蘇丹紅I號(hào)和對位紅被人體攝入后，均有潛在致痛可能，尤其容易誘發(fā)肝臟細(xì)胞基因發(fā)生變異，增加人體肝臟癌變的幾率。我國頒布的《中華人民共和國食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB2760--1996)批準(zhǔn)使用的食用色素品種中沒有蘇丹紅I號(hào)和對位紅。但因其良好的著色功能，可以長期保持食物鮮亮的外觀，而且價(jià)格低廉，仍被違規(guī)當(dāng)作食用色素添加于多種食品中。因此，找到快速有效檢測食品中蘇丹紅I號(hào)和對位紅添加劑的方

3、法是非常必須，也是刻不容緩的。
　　 本論文基于完全抗原制備方法、動(dòng)物免疫血清制備方法、單克隆抗體制備方法、以及抗體大量分泌的體內(nèi)腹水制備方法，擬建立一種能夠同時(shí)檢測水溶性食品中蘇丹紅I號(hào)和對位紅的競爭酶聯(lián)免疫吸附檢測法。本論文主要分為以下三個(gè)部分：
　　 一、免疫抗原及包被抗原的制備
　　 將蘇丹紅I號(hào)和對位紅結(jié)構(gòu)相似部分與載體蛋白BSA和OVA分別偶聯(lián)，采用碳二亞胺法，制得免疫抗原蘇丹紅I-BSA和包被抗原蘇

4、丹紅I-OVA。偶聯(lián)物通過肉眼觀察、紫外分光光度檢測法、拉曼光譜檢測法進(jìn)行結(jié)果鑒定。
　　 二、單克隆抗體的制備
　　 免疫BALB/c小鼠，取血清效價(jià)最高的小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，通過HAT選擇性培養(yǎng)基篩選，獲得雜交瘤細(xì)胞，再經(jīng)有限稀釋法篩選，得到分泌蘇丹紅抗體陽性率最高的雜交瘤細(xì)胞株。將該細(xì)胞株接種至健康BALB/c小鼠腹腔，產(chǎn)生的腹水經(jīng)辛酸-飽和硫酸銨法純化，獲得腹水型蘇丹紅單克隆抗體。
　　

5、 三、檢測方法的建立
　　 采用間接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析法，經(jīng)前期條件優(yōu)化后，建立一種能同時(shí)檢測蘇丹紅I號(hào)和對位紅的檢測法。用乙腈法分別提取番茄醬中的蘇丹紅I號(hào)或者對位紅，與標(biāo)準(zhǔn)品曲線比較后，可計(jì)算得出回收率。
　　 1、偶聯(lián)實(shí)驗(yàn)成功，獲得兩種完全抗原：蘇丹紅I號(hào)與牛血清白蛋白(BSA)的交聯(lián)復(fù)合物，以及蘇丹紅I號(hào)與卵清白蛋白(OVA)的交聯(lián)復(fù)合物；
　　 2、通過細(xì)胞融合后篩選，獲得能大量分泌特異性抗蘇丹紅I

6、號(hào)和對位紅的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并且獲得只含有效抗體蛋白成分的腹水型單抗溶液，效價(jià)達(dá)到1:128000;
　　 3、成功建立一種能同時(shí)檢測蘇丹紅I號(hào)和對位紅的競爭ELISA檢測方法，該法靈敏度高、特異性強(qiáng)，對蘇丹紅I號(hào)和對位紅的IC50值分別為0.8μg/L和4μg/L，與蘇丹紅II、III、Ⅳ號(hào)的交叉反應(yīng)率為1.24％～2.12％，對四種常用無關(guān)添加劑的交叉反應(yīng)率均小于0.2％；
　　 4、運(yùn)用所建方法檢測番茄醬