內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白3參與自噬并影響膽固醇流出機(jī)制初探.pdf

1、目的:本研究以肝癌細(xì)胞HepG2為研究對(duì)象，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白3(Reticulon3，RTN3)與自噬的關(guān)系，并對(duì)RTN3參與細(xì)胞脂質(zhì)代謝與膽固醇流出及其可能的機(jī)制做初步的探討。
　　方法:(1)通過(guò)營(yíng)養(yǎng)剝奪誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬，WB檢測(cè)RTN3和自噬蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B(microtubule-associated protein1 lightchain3B，LC3B)的蛋白水平，并調(diào)節(jié)RTN3表達(dá)水平檢測(cè)Beclin1與LC3

2、B的含量，激光共聚焦檢測(cè)RTN3是否參與自噬泡形成。(2)免疫共沉淀檢測(cè)RTN3是否與Bcl-2和Beclin1有相互作用，激光共聚焦檢測(cè)它們是否有共定位。(3)不同濃度HDL和他汀刺激取樣WB檢測(cè)RTN3與LC3B表達(dá)變化，探討RTN3是否參與調(diào)控相關(guān)脂質(zhì)的代謝過(guò)程。(4)調(diào)節(jié)RTN3表達(dá)用油紅O染色檢測(cè)胞內(nèi)脂質(zhì)變化，并用膽固醇流出檢測(cè)RTN3對(duì)膽固醇流出的影響。(5)調(diào)節(jié)RTN3表達(dá)并用WB檢測(cè)RTN3與ABCA1表達(dá)變化，在HDL

3、和他汀刺激下檢測(cè)RTN3與ABCA1是否有共定位，初步探討RTN3參與膽固醇流出機(jī)制。
　　結(jié)果:(1)營(yíng)養(yǎng)剝奪誘導(dǎo)細(xì)胞自噬時(shí)，RTN3和LC3B均表達(dá)上調(diào)，上調(diào)RTN3表達(dá)則使LC3B明顯增高;激光共聚焦實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LC3B和RTN3存在共定位。(2)免疫共沉淀和激光共聚焦結(jié)果表明RTN3與Beclin1存在相互作用。(3)隨著HDL濃度增加，RTN3和LC3B均表達(dá)下調(diào)，他汀濃度增加時(shí)，RTN3和LC3B均表達(dá)上調(diào)。(4)油紅O染

4、色發(fā)現(xiàn)在RTN3高表達(dá)的細(xì)胞中脂滴數(shù)量下降，而RTN3低表達(dá)時(shí)脂滴在細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)累積。當(dāng)無(wú)HDL處理且RTN3高表達(dá)時(shí)膽固醇流出率高于RTN3低表達(dá)和正常組，在高濃度HDL誘導(dǎo)膽固醇流出時(shí)，RTN3高表達(dá)和低表達(dá)均抑制膽固醇流出。(5)在RTN3高表達(dá)和低表達(dá)時(shí)，ABCA1蛋白表達(dá)下降，并檢測(cè)到ABCA1與RTN3共定位于胞內(nèi)囊泡中。
　　結(jié)論:(1) RTN3與Beclin1相互作用影響HepG2細(xì)胞的自噬水平;(2) RTN3可