蟾毒靈通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞凋亡與自噬的分子機制研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，盡管目前應(yīng)對腫瘤有多種治療措施，但惡性膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后仍較差，因此尋找新型抗腫瘤藥物依然具有重要意義。蟾毒靈是中藥蟾酥的主要成分，是從中華大蟾蜍分泌的毒液中提取的，目前，對蟾毒靈抗腫瘤機制的研究多集中在各種類型的肝癌細胞，其對膠質(zhì)瘤細胞的作用尚未見報道。本實驗的目的是研究蟾毒靈對膠質(zhì)瘤的生長是否具有抑制作用，并探討其相應(yīng)的分子機制。
　　用不同濃度蟾毒靈作用U87MG細胞24或48小時，選取各種

2、方法處理，觀察處理后的細胞形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特性的變化。細胞增殖抑制實驗(MTT)觀察不同處理對細胞增殖的影響;流式細胞術(shù)檢測ROS水平的變化及細胞凋亡情況;吖啶橙和MDC染色觀察自噬泡的存在，從而檢測細胞自噬水平的變化;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染si-RNA以降低某一基因的表達;蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測不同處理后凋亡、自噬及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達水平的變化。
　　MTT結(jié)果表明，用不同濃度蟾毒靈處理U87MG細胞24和48

3、小時，蟾毒靈可有效抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖。Bax/Bcl-2比值升高，細胞色素c及CleavedCaspase-3和Cleaved PARP的上調(diào)表明，蟾毒靈可誘導(dǎo)U87MG細胞發(fā)生線粒體途徑凋亡。
　　蟾毒靈可激活自噬的證據(jù)包括酸性自噬泡的形成、自噬溶酶體的增加及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的上調(diào)。進一步的實驗表明，蟾毒靈誘導(dǎo)自噬的機制與其降低細胞內(nèi)ATP含量、激活A(yù)MPK，抑制mTOR及其下游蛋白4EBP1和p70S6K有關(guān)。

4、　　用自噬抑制劑3-MA抑制自噬可增強蟾毒靈誘導(dǎo)的細胞凋亡并促進凋亡蛋白Cleaved Caspse-3及Cleaved PARP的表達。干擾自噬基因Beclin1或Atg5后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ灰度比降低，而凋亡蛋白cleaved PARP活性增強。這些結(jié)果說明自噬在蟾毒靈誘導(dǎo)的細胞凋亡中發(fā)揮保護性作用。
　　蟾毒靈誘導(dǎo)U87MG細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的證據(jù)包括非折疊蛋白反應(yīng)(UPR)感受蛋白PERK、IRE1α、eIF2α的磷酸化

5、水平升高和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志蛋白GRP78和GRP94的表達量的上調(diào)。CHOP和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡特有的Caspase4的激活，表明蟾毒靈還可誘導(dǎo)U87MG細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所介導(dǎo)的凋亡。此外，用si-CHOP抑制CHOP的表達可使蟾毒靈誘導(dǎo)的細胞凋亡率下降，這進一步說明了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在蟾毒靈誘導(dǎo)凋亡中的重要作用。周內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑TUDC或干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白eIF2α、CHOP的表達，可部分抑制蟾毒靈誘導(dǎo)的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的上調(diào)，說明內(nèi)質(zhì)