中國(guó)鹵蟲(chóng)甘油激酶基因(As--gk)在胚胎滯育解除過(guò)程中的表達(dá)模式分析.pdf

1、分類(lèi)號(hào)：密級(jí)：學(xué)校代碼： 1 0 1 6 5學(xué) 號(hào)：2 0 1 1 1 1 1 5 5遣掌研耗大學(xué)碩士學(xué)位論文⑦中國(guó)鹵蟲(chóng)甘油激酶基因( 彳s 嘶) 在胚胎滯育解除過(guò)程中的表達(dá)模式分析作者姓名：學(xué)科、專(zhuān)業(yè)：研究方向：導(dǎo)師姓名：程誠(chéng)海洋生物學(xué)海洋動(dòng)物發(fā)育與分子遺傳學(xué)侯林教授2014 年3 月遼寧師范大學(xué)碩士學(xué)位論文摘 要中國(guó)鹵蟲(chóng)( A r t e m i a s i n i c a ) 廣泛分布于沿海鹽池和內(nèi)陸鹽湖中，是一種廣溫、耐高鹽的小

2、型甲殼動(dòng)物。鹵蟲(chóng)具有較強(qiáng)的抗逆能力，在缺氧、高鹽、干燥、低溫、食物匱乏、日照時(shí)間縮短等條件下能產(chǎn)出休眠卵，其胚胎發(fā)育被阻滯在原腸胚時(shí)期。當(dāng)環(huán)境條件適宜時(shí)，休眠卵的滯育解除，胚胎發(fā)育被重新啟動(dòng)。甘油激酶( g l y c e r o lk i n a s e ，G K ) 催化甘油磷酸化反應(yīng)形成3 ．磷酸甘油，反應(yīng)過(guò)程中需M 9 2 + 和A T P 的參與，是甘油利用過(guò)程中的限速酶。3 一磷酸甘油是能量代謝及甘油酯的生產(chǎn)過(guò)程中一種重要的

3、中問(wèn)產(chǎn)物。鹵蟲(chóng)在滯育過(guò)程中積累了大量的目‘油作為冷凍保護(hù)劑以抵御低溫和干旱的傷害，在胚胎發(fā)育恢復(fù)時(shí)，被轉(zhuǎn)化為糖類(lèi)及其他碳水化合物。因此，甘油激酶在滯育解除過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但其在中國(guó)鹵蟲(chóng)滯育及滯育解除過(guò)程中的作用尚不清楚。本研究采用R A C E 技術(shù)首次得到中國(guó)鹵蟲(chóng)A s - g k 的c D N A 全長(zhǎng)，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)及分子進(jìn)化方面的分析。爿s _ 積全長(zhǎng)2 0 9 6 b p ，包含3 2 6 b p5 ’和l 1 4

4、 b p 3 ’非編碼區(qū)，1 6 5 6 b p 的開(kāi)放閱讀框。此基因編碼的G K 蛋白含有5 5 1 個(gè)氨基酸殘基，包含一個(gè)典型的g l y c e r o l k i n a s e 結(jié)構(gòu)域，屬于F G G Y 家族的成員。多序列比對(duì)分析表明，G K 作為甘油利用與代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，在進(jìn)化過(guò)程中具有結(jié)構(gòu)與功能上的保守性。利用原位雜交技術(shù)對(duì)爿s —辦的表達(dá)部位進(jìn)行了分析，爿s —貼廣泛分布于早期發(fā)育的胚胎( 0 - 2 0 h )

5、。蟲(chóng)體出現(xiàn)分化后( 4 0 h ) ，頭胸部、腹部、體表、附肢、消化道和卵巢能檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)，與早期哺乳動(dòng)物和果蠅中對(duì)表達(dá)部位的研究成果有一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系。利用原核表達(dá)系統(tǒng)在體外誘導(dǎo)表達(dá)與純化出了重組A s ．G K 蛋白。采用熒光實(shí)時(shí)定量P C R 與蛋白免疫印跡技術(shù)，對(duì)甘油激酶的表達(dá)模式進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示其在鹵蟲(chóng)胚胎發(fā)育的早期具有較高的表達(dá)( 1 0 h ) ，表明甘油激酶作為限速酶，在滯育解除后甘油的分解代謝中發(fā)揮了重要的作用，伴

6、隨滯育期間積累的甘油被逐漸消耗，爿s 私轉(zhuǎn)錄量下調(diào)。爿s ．醇在鹽度刺激與溫度脅迫下的表達(dá)模式分析結(jié)果顯示，在鹽度升高或溫度降低時(shí)，基因表達(dá)顯著上調(diào)，說(shuō)明A s - g k 對(duì)溫度和鹽度的變化有一定的敏感性，在受到低溫和高鹽的脅迫時(shí)表達(dá)量升高，起到保護(hù)胚胎的作用，證明其是與脅迫相關(guān)的蛋白。本研究旨在闡明中國(guó)鹵蟲(chóng)滯育解除及胚胎發(fā)育的早期甘油代謝中G K 的作用，對(duì)研究鹵蟲(chóng)滯育的分子機(jī)制具有較為重要的理論意義，對(duì)開(kāi)發(fā)利用鹵蟲(chóng)資源具有一定的應(yīng)