全內(nèi)反射熒光法研究蛋白質(zhì)與殼聚糖的相互作用.pdf

1、殼聚糖作為重要的天然聚合物，以良好的生物相容性、生物可降解性，對(duì)細(xì)胞組織不產(chǎn)生毒性影響，在生物醫(yī)學(xué)等方面得到了廣泛的研究應(yīng)用。殼聚糖對(duì)蛋白質(zhì)有良好的親和能力，研究蛋白質(zhì)與殼聚糖在界面上的相互作用、理解蛋白質(zhì)與殼聚糖分子在界面接觸時(shí)的吸附過程變化對(duì)蛋白藥物的開發(fā)和生物化學(xué)研究具有非常重要的意義。全內(nèi)反射熒光法是研究界面蛋白質(zhì)吸附的一種有效的手段。它利用指數(shù)衰減的倏逝波選擇性激發(fā)介質(zhì)表面的熒光團(tuán)分子，產(chǎn)生全內(nèi)反射熒光，具有高度的界面(表面)

2、特異性，從而可有效排除本體干擾，獲取界面信息，而且又具有非破壞性，能夠?qū)崟r(shí)、原位檢測(cè)蛋白質(zhì)吸附過程。本文致力于改進(jìn)實(shí)驗(yàn)室已有的固/液界面全內(nèi)反射熒光分析的部件，考察殼聚糖超薄膜的固定方案，繼而研究三種模型蛋白在殼聚糖超薄膜上的吸附情況。此外，還對(duì)羅丹明6G(R6G)在石英/水界面上的吸附進(jìn)行研究，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)咕噸染料在界面的情況。論文分為四章： 第一章綜述了全內(nèi)反射熒光法在生物體系中的研究應(yīng)用，以及殼聚糖與蛋白質(zhì)相互作用的研究概況

3、。簡(jiǎn)要介紹全內(nèi)反射熒光法的原理和應(yīng)用，對(duì)目前全內(nèi)反射熒光法在生物體系，特別是固/液界面蛋白質(zhì)吸附的研究作了詳盡的概述，同時(shí)還介紹了殼聚糖的性質(zhì)、應(yīng)用以及它與蛋白質(zhì)相互作用研究的狀況，最后提出整篇論文的設(shè)想。 第二章在現(xiàn)有可行的實(shí)驗(yàn)條件下，以石英片為載體，改進(jìn)實(shí)驗(yàn)室已有全內(nèi)反射熒光部件，使其易于進(jìn)行表面修飾，并且使樣品的檢測(cè)體積減少至200μL?？疾炝诵糠ㄅc化學(xué)鍵合法固定殼聚糖薄膜的情況，同時(shí)應(yīng)用全內(nèi)反射恒波長(zhǎng)同步熒光分析方法，

4、監(jiān)測(cè)殼聚糖表面固定情況。最后確定了以硅烷化試劑自組裝在石英載體上引入活性基團(tuán)進(jìn)行表面接枝殼聚糖的化學(xué)鍵合法，并對(duì)接枝方法進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了表面均一的殼聚糖超薄膜。 第三章用熒光素異硫氰酸酯(FITC)標(biāo)記常見的模型球型蛋白(牛血清白蛋白、溶菌酶、牛血纖維蛋白原)，應(yīng)用全內(nèi)反射熒光法分析它們分別與殼聚糖超薄膜相互作用的情況，以及對(duì)牛血纖維蛋白原和牛血清白蛋白的二元競(jìng)爭(zhēng)吸附體系進(jìn)行研究。 首先成功用FITC標(biāo)記各種模型蛋白質(zhì)

5、，標(biāo)記率在0.6—3.8之間，觀測(cè)其吸收、熒光波長(zhǎng)均有所紅移，熒光各向異性值有6—10倍的增長(zhǎng)。 牛血清白蛋白(BSA)在殼聚糖上隨著本體濃度增加，出現(xiàn)兩個(gè)吸附增長(zhǎng)區(qū)。隨濃度增加，吸附在殼聚糖表面上的BSA可能從平躺取向排布向豎直取向變化；在平衡濃度大于400μg/mL以上可能出現(xiàn)多層吸附。pH對(duì)BSA在殼聚糖上的吸附作用也有顯著的影響，隨著pH增加，BSA在pH6.5附近出現(xiàn)了極值，說明主要以靜電相互作用驅(qū)動(dòng)了BSA吸附。離子

6、強(qiáng)度的增加，屏蔽了蛋白質(zhì)與殼聚糖表面、蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)分子之間的靜電斥力，使得BSA的吸附量增加；而當(dāng)鹽濃度大于0.1 mol/L之后，由于殼聚糖分子鏈的剛性變小，容易成團(tuán)，與蛋白質(zhì)接觸面積減小，導(dǎo)致吸附量下降。 此外，還考察了另外兩種模型蛋白吸附隨本體溶液濃度變化的影響，以及對(duì)模型蛋白的吸附過程進(jìn)行動(dòng)力學(xué)方程擬合。牛血纖維蛋白原的界面熒光隨著蛋白質(zhì)本體濃度的增加而增加；在低濃度下，雙常數(shù)速率方程能夠得到較好擬合性，而在高濃度下，

7、準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型能夠得到較好的擬合性。而溶菌酶在考察濃度范圍內(nèi)，界面信號(hào)隨濃度增長(zhǎng)變化曲線與Langmuir吸附等溫線形狀近似。溶菌酶對(duì)殼聚糖的表面親和能力比BSA更好，這可能由于殼聚糖與溶菌酶的底物結(jié)構(gòu)相似，溶菌酶易吸附于殼聚糖膜上。溶菌酶的吸附動(dòng)力學(xué)過程可用準(zhǔn)二級(jí)吸附動(dòng)力學(xué)模型描述，隨著吸附初始濃度的增加，吸附速率常數(shù)k也總體有一個(gè)數(shù)量級(jí)的增長(zhǎng)。 比較殼聚糖膜上BSA與牛血纖維蛋白原在生理?xiàng)l件下競(jìng)爭(zhēng)吸附的情況，在殼聚糖界面上

8、，牛血纖維蛋白原的相對(duì)競(jìng)爭(zhēng)吸附能力要大于BSA。這表明殼聚糖也能夠正常驅(qū)動(dòng)牛血纖維蛋白原的吸附，激發(fā)血小板和凝血因子而發(fā)生凝血。 第四章利用全內(nèi)反射恒波長(zhǎng)同步熒光法直接測(cè)量在石英/水界面上的羅丹明6G(R6G)。通過對(duì)其本體、界面熒光光譜的分析，觀察到R6G分子在親水石英/水界面上出現(xiàn)5 nm紅移，紅移的原因主要是染料分子旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)受到限制，石英表面的剛性限制了分子的自由度，同時(shí)，石英/水界面更低的極性也對(duì)紅移產(chǎn)生影響。同時(shí)還考察