無膠篩分毛細(xì)管電泳檢測基因突變的方法學(xué)研究.pdf

1、癌癥的早期診斷對其治愈起著重要的作用。研究表明基因突變在癌癥的發(fā)生中起著不可忽視的作用，基因突變的檢測成為癌癥早期診斷的重要手段。目前幾乎所有的基因突變檢測都是建立于PCR的基礎(chǔ)之上，操作簡便準(zhǔn)確率高的基因分析技術(shù)——限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)常與PCR技術(shù)結(jié)合用于基因突變的檢測。PCR-RFLP檢測基因突變的結(jié)果往往需要借助電泳技術(shù)顯示。傳統(tǒng)的平板凝膠電泳分辨率低、分析時(shí)間長，不能很好的用于各種長度DNA片段尤其是小DNA片段的

2、多態(tài)性分析。 無膠篩分毛細(xì)管電泳(NGS-CE)是一種新型電泳與色譜相結(jié)合的分離分析技術(shù)，具有分離效率高、分析速度快、樣品用量少等特點(diǎn)，已經(jīng)成為分離分析DNA片段的重要方法之一。篩分介質(zhì)特性、篩分介質(zhì)中的添加劑、電泳緩沖液的pH、電泳溫度、電場強(qiáng)度、電滲流等參數(shù)都不同程度的影響NGS-CE分離DNA的效果，其中，篩分介質(zhì)特性對NGS-CE分離DNA的影響最為顯著。 為了將NGS-CE更好地應(yīng)用于癌癥的早期診斷，本論文分成

3、兩部分對NGS-CE檢測基因突變的方法進(jìn)行系統(tǒng)的研究。 第一部分主要研究了兩種不同長度線性聚丙烯酰胺的合成及其對DNA的分離。在聚合反應(yīng)中加入不同比例的鏈轉(zhuǎn)移劑異丙醇得到分子鏈長度不同的兩種線性聚丙烯酰胺(LPA Ⅰ和LPA Ⅱ)，系統(tǒng)分析了兩種LPA的物理特性及其分離DNA的差異。兩種LPA具有不同的分子量、交纏臨界濃度和旋轉(zhuǎn)半徑，但它們在相同的濃度下卻具有相同的篩分孔徑。兩種LPA在最佳分離條件下均能成功分離PBR322/B

4、suRI DNA Marker中小于70bp DNA片段，且得到較高的分離度，另外，以LPA Ⅰ作為篩分介質(zhì)得到較LPA Ⅱ更大的分離度，以LPA Ⅱ作為篩分介質(zhì)需要較LPA Ⅰ更短的分析時(shí)間，它們都可用于臨床和基礎(chǔ)研究中小于70bp DNA片段的分析，在臨床和基礎(chǔ)研究中建立了一種快速、靈敏分析小于70bp DNA片段的方法。本文還嘗試性地將兩種LPA用于較大DNA片段的分離，它們在任何分離條件下均不能實(shí)現(xiàn)1Kb DNA Marker

5、P中13條DNA片段的完全分離，最多只能得到11個色譜峰。 第二部分主要是將以上建立的快速、靈敏分析小于70bp DNA片段的方法與PCR-RFLP技術(shù)相結(jié)合用于胃癌組織p53基因248位、249位密碼子突變情況的同時(shí)檢測。提取了59例胃癌患者的癌組織及癌旁正常組織的基因組DNA，經(jīng)測定所提取的DNA濃度適中，純度較好。利用PCR擴(kuò)增p53基因上包含248位與249位密碼子長度為200bp的DNA片段。使用UNIQ-10柱式DN

6、A膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，排除了PCR產(chǎn)物中離子和引物二聚體對后續(xù)研究的干擾。限制性內(nèi)切酶Msp Ⅰ和HaeⅢ同時(shí)切割純化的PCR產(chǎn)物，然后以NGS-CE分離小于 70bp DNA片段時(shí)獲得最高分離度的電泳條件(篩分介質(zhì)為8﹪LPA Ⅰ、添加劑甘露醇濃度為8﹪、pH為6.5、溫度為15℃、電場強(qiáng)度為275V/cm)分析臨床59例胃癌患者p53基因擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性片段長度多態(tài)性。30min內(nèi)同時(shí)檢測了p53基因中248位和249位兩個