基于生物樣品在線富集技術(shù)的臨床毛細(xì)管電泳方法學(xué)研究.pdf

1、臨床生物樣品分析是臨床藥物治療的重要輔助手段，是化學(xué)、生物學(xué)與醫(yī)學(xué)的橋梁。臨床生物樣品分析主要包括代謝組學(xué)研究，臨床治療藥物監(jiān)測(cè)、藥代動(dòng)力學(xué)研究和生化樣品分析。常見的生物樣品分析方法有色譜法、光譜法、微生物法和免疫法。較其他三種方法，色譜法能夠結(jié)合光譜法，免疫法和生物法的優(yōu)勢(shì)，利用自身的分離效能，能夠準(zhǔn)確，有效地分離分析臨床生物樣品。主流的色譜分析法為氣相色譜法、高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳法。
　　 近幾年，毛細(xì)管電泳作為一種新

2、型的分離分析技術(shù)，較常規(guī)色譜有分析速度快、分離效能高，分析成本低，使用分析體系較其他色譜法更接近生物體液環(huán)境的優(yōu)勢(shì)，而越來越被重視，成為主流的生物樣品分析方法。但當(dāng)使用紫外檢測(cè)器時(shí)，由于毛細(xì)管電泳的進(jìn)樣量和檢測(cè)窗小，靈敏度受到限制。為了解決這個(gè)問題，場(chǎng)放大技術(shù)在毛細(xì)管電泳中起到了至關(guān)重要的作用。它主要原理是分析物在兩個(gè)導(dǎo)電性不同的相界而上電泳速度的不同而形成富集效應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)較高靈敏度的快速分離分析。
　　 本課題選擇鹽酸氨溴索

3、、苯磺酸氨氯地平及米氮平為研究對(duì)象，是因?yàn)樗鼈兘o藥劑量小，半衰期長(zhǎng)，血藥濃度低，希望通過建立合適的在線場(chǎng)放大毛細(xì)管電泳法，實(shí)現(xiàn)靈敏、快速、低耗的分離分析，并將其用于測(cè)定鹽酸氨溴索、苯磺酸氨氯地平對(duì)映體及米氮平和米氮平代謝產(chǎn)物在人血漿中的濃度。實(shí)驗(yàn)中，研究毛細(xì)管區(qū)帶電泳在進(jìn)行生物樣品分析時(shí)分離電壓、流動(dòng)相組成及緩沖液pH值對(duì)目標(biāo)成份分析時(shí)問的影響，考察了進(jìn)樣方式、時(shí)間和電壓、樣品溶液中有機(jī)試劑的濃度對(duì)樣品在線場(chǎng)放大技術(shù)的作用效果，同時(shí)比較

4、了不同環(huán)糊精及其濃度對(duì)由于場(chǎng)放大作用導(dǎo)致的不對(duì)稱峰形改善的效果及對(duì)手性藥物拆分的效果。結(jié)果顯示，在線場(chǎng)放大技術(shù)使得毛細(xì)管電泳-紫外檢測(cè)法的靈敏度顯著提高，能夠滿足生物樣品檢測(cè)的要求，并且緩沖液中添加合適的環(huán)糊精可以改善分析物的峰形，同時(shí)可以實(shí)現(xiàn)手性藥物的拆分。將毛細(xì)管電泳技術(shù)和環(huán)糊精輔助的在線場(chǎng)放大技術(shù)聯(lián)用，能有效地縮短了分析時(shí)間，提高了檢測(cè)靈敏度，常規(guī)條件下即可實(shí)現(xiàn)臨床生物樣品的快速、靈敏、準(zhǔn)確的分析。
　　 藥物代謝動(dòng)力學(xué)是

5、定量描述藥物進(jìn)入體內(nèi)以后的吸收、分布、代謝、排泄過程，通過測(cè)定生物樣本中的藥物或者代謝產(chǎn)物的濃度，可以更好的闡明藥物的藥效或者毒性，為新藥研究的代謝篩選和臨床用藥的安全有效提供重要依據(jù)。針對(duì)人血漿中的鹽酸氨溴索，采用毛細(xì)管柱（長(zhǎng)度31.2cm，內(nèi)徑75μm，有效長(zhǎng)度21cm）進(jìn)行分離分析，運(yùn)行電壓15kV，運(yùn)行緩沖液為25mM磷酸二氫鈉-6.25mM硼砂（10％磷酸調(diào)pH3.0）及1mMβ-環(huán)糊精，電遷移進(jìn)樣7.5kV×15s，柱溫25

6、℃，紫外波長(zhǎng)為210nm。采用96孔板液液萃取對(duì)200μL血漿進(jìn)行樣品前處理后進(jìn)樣分析，氨溴索和內(nèi)標(biāo)苯海拉明的保留時(shí)間分別為3.6和4.3分鐘。與以往方法相比此法能夠滿足血藥濃度測(cè)定的靈敏度同時(shí)縮短了分析時(shí)間，提高了樣品分析的速度，測(cè)定結(jié)果和常規(guī)方法相當(dāng)。
　　 在很多手性藥物中，對(duì)映體在生物利用度、對(duì)受體、轉(zhuǎn)運(yùn)體和/或酶的選擇性、代謝速率、代謝產(chǎn)物及毒性等方面都有所差異，因此，對(duì)手性藥物藥代動(dòng)力學(xué)的研究是有必要的。氨氯地平消旋

7、體中，左旋和右旋氨氯地平的比例是1∶1，但是只有左旋氨氯地平有藥理活性。針對(duì)人血漿中的氨氯地平手性對(duì)映體，采用毛細(xì)管柱（長(zhǎng)度31.2cm，內(nèi)徑75μm，有效長(zhǎng)度21cm）進(jìn)行分離分析，運(yùn)行電壓15kV，運(yùn)行緩沖液為25mM磷酸二氫鈉-6.25mM硼砂（10％磷酸調(diào)pH2.5）及30mg/mL羥丙基-β-環(huán)糊精，電遷移進(jìn)樣5kV×10s，柱溫25℃，紫外波長(zhǎng)為200nm。采用固相萃取對(duì)1mL血漿進(jìn)行樣品前處理后進(jìn)樣分析。血漿中氨氯地平手性

8、對(duì)映體和內(nèi)標(biāo)苯海拉明的保留時(shí)間分別為5.7、6.2和6.7分鐘。本實(shí)驗(yàn)建立了靈敏、快速、耗材少的毛細(xì)管電泳-紫外檢測(cè)法用于測(cè)定臨床生物樣品中手性藥物，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與以往的方法無顯著差異。
　　 治療藥物監(jiān)測(cè)是探討患者體內(nèi)血藥濃度與療效及毒性之間的關(guān)系，從而確定個(gè)體的最適治療劑量及最佳用藥方案，提高藥物療效和減少不良反應(yīng)，其對(duì)于實(shí)現(xiàn)臨床合理、安全用藥有重要的意義。尤其在精神病學(xué)的臨床運(yùn)用中，對(duì)抗精神病藥物進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)一直被認(rèn)為是有

9、重要意義的。左旋和右旋米氮平有不同的藥動(dòng)學(xué)及藥效學(xué)參數(shù)，實(shí)驗(yàn)針對(duì)人血中米氮平及其代謝產(chǎn)物的手性對(duì)映體，采用毛細(xì)管柱(長(zhǎng)度40.2 cm，內(nèi)徑75μm，有效長(zhǎng)度30 cm)進(jìn)行分離分析，運(yùn)行電壓17 kV，運(yùn)行緩沖液為25 mM磷酸二氫鈉-6.25 mM硼砂（10％磷酸調(diào)pH2.5）及6.5 mg/mL羧甲基-β-環(huán)糊精，電遷移進(jìn)樣7.5 kV×10s，柱溫25℃，紫外波長(zhǎng)為200 nm。采用96孔板液液萃取對(duì)300μL血漿進(jìn)行樣品前處理