基于生物樣品在線富集技術(shù)的臨床毛細(xì)管電泳方法學(xué)研究.pdf

1、臨床生物樣品分析是臨床藥物治療的重要輔助手段，是化學(xué)、生物學(xué)與醫(yī)學(xué)的橋梁。臨床生物樣品分析主要包括代謝組學(xué)研究，臨床治療藥物監(jiān)測、藥代動力學(xué)研究和生化樣品分析。常見的生物樣品分析方法有色譜法、光譜法、微生物法和免疫法。較其他三種方法，色譜法能夠結(jié)合光譜法，免疫法和生物法的優(yōu)勢，利用自身的分離效能，能夠準(zhǔn)確，有效地分離分析臨床生物樣品。主流的色譜分析法為氣相色譜法、高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳法。
　　 近幾年，毛細(xì)管電泳作為一種新

2、型的分離分析技術(shù)，較常規(guī)色譜有分析速度快、分離效能高，分析成本低，使用分析體系較其他色譜法更接近生物體液環(huán)境的優(yōu)勢，而越來越被重視，成為主流的生物樣品分析方法。但當(dāng)使用紫外檢測器時，由于毛細(xì)管電泳的進樣量和檢測窗小，靈敏度受到限制。為了解決這個問題，場放大技術(shù)在毛細(xì)管電泳中起到了至關(guān)重要的作用。它主要原理是分析物在兩個導(dǎo)電性不同的相界而上電泳速度的不同而形成富集效應(yīng)，從而實現(xiàn)較高靈敏度的快速分離分析。
　　 本課題選擇鹽酸氨溴索

3、、苯磺酸氨氯地平及米氮平為研究對象，是因為它們給藥劑量小，半衰期長，血藥濃度低，希望通過建立合適的在線場放大毛細(xì)管電泳法，實現(xiàn)靈敏、快速、低耗的分離分析，并將其用于測定鹽酸氨溴索、苯磺酸氨氯地平對映體及米氮平和米氮平代謝產(chǎn)物在人血漿中的濃度。實驗中，研究毛細(xì)管區(qū)帶電泳在進行生物樣品分析時分離電壓、流動相組成及緩沖液pH值對目標(biāo)成份分析時問的影響，考察了進樣方式、時間和電壓、樣品溶液中有機試劑的濃度對樣品在線場放大技術(shù)的作用效果，同時比較

4、了不同環(huán)糊精及其濃度對由于場放大作用導(dǎo)致的不對稱峰形改善的效果及對手性藥物拆分的效果。結(jié)果顯示，在線場放大技術(shù)使得毛細(xì)管電泳-紫外檢測法的靈敏度顯著提高，能夠滿足生物樣品檢測的要求，并且緩沖液中添加合適的環(huán)糊精可以改善分析物的峰形，同時可以實現(xiàn)手性藥物的拆分。將毛細(xì)管電泳技術(shù)和環(huán)糊精輔助的在線場放大技術(shù)聯(lián)用，能有效地縮短了分析時間，提高了檢測靈敏度，常規(guī)條件下即可實現(xiàn)臨床生物樣品的快速、靈敏、準(zhǔn)確的分析。
　　 藥物代謝動力學(xué)是

5、定量描述藥物進入體內(nèi)以后的吸收、分布、代謝、排泄過程，通過測定生物樣本中的藥物或者代謝產(chǎn)物的濃度，可以更好的闡明藥物的藥效或者毒性，為新藥研究的代謝篩選和臨床用藥的安全有效提供重要依據(jù)。針對人血漿中的鹽酸氨溴索，采用毛細(xì)管柱（長度31.2cm，內(nèi)徑75μm，有效長度21cm）進行分離分析，運行電壓15kV，運行緩沖液為25mM磷酸二氫鈉-6.25mM硼砂（10％磷酸調(diào)pH3.0）及1mMβ-環(huán)糊精，電遷移進樣7.5kV×15s，柱溫25

6、℃，紫外波長為210nm。采用96孔板液液萃取對200μL血漿進行樣品前處理后進樣分析，氨溴索和內(nèi)標(biāo)苯海拉明的保留時間分別為3.6和4.3分鐘。與以往方法相比此法能夠滿足血藥濃度測定的靈敏度同時縮短了分析時間，提高了樣品分析的速度，測定結(jié)果和常規(guī)方法相當(dāng)。
　　 在很多手性藥物中，對映體在生物利用度、對受體、轉(zhuǎn)運體和/或酶的選擇性、代謝速率、代謝產(chǎn)物及毒性等方面都有所差異，因此，對手性藥物藥代動力學(xué)的研究是有必要的。氨氯地平消旋

7、體中，左旋和右旋氨氯地平的比例是1∶1，但是只有左旋氨氯地平有藥理活性。針對人血漿中的氨氯地平手性對映體，采用毛細(xì)管柱（長度31.2cm，內(nèi)徑75μm，有效長度21cm）進行分離分析，運行電壓15kV，運行緩沖液為25mM磷酸二氫鈉-6.25mM硼砂（10％磷酸調(diào)pH2.5）及30mg/mL羥丙基-β-環(huán)糊精，電遷移進樣5kV×10s，柱溫25℃，紫外波長為200nm。采用固相萃取對1mL血漿進行樣品前處理后進樣分析。血漿中氨氯地平手性

8、對映體和內(nèi)標(biāo)苯海拉明的保留時間分別為5.7、6.2和6.7分鐘。本實驗建立了靈敏、快速、耗材少的毛細(xì)管電泳-紫外檢測法用于測定臨床生物樣品中手性藥物，實驗數(shù)據(jù)與以往的方法無顯著差異。
　　 治療藥物監(jiān)測是探討患者體內(nèi)血藥濃度與療效及毒性之間的關(guān)系，從而確定個體的最適治療劑量及最佳用藥方案，提高藥物療效和減少不良反應(yīng)，其對于實現(xiàn)臨床合理、安全用藥有重要的意義。尤其在精神病學(xué)的臨床運用中，對抗精神病藥物進行治療藥物監(jiān)測一直被認(rèn)為是有

9、重要意義的。左旋和右旋米氮平有不同的藥動學(xué)及藥效學(xué)參數(shù)，實驗針對人血中米氮平及其代謝產(chǎn)物的手性對映體，采用毛細(xì)管柱(長度40.2 cm，內(nèi)徑75μm，有效長度30 cm)進行分離分析，運行電壓17 kV，運行緩沖液為25 mM磷酸二氫鈉-6.25 mM硼砂（10％磷酸調(diào)pH2.5）及6.5 mg/mL羧甲基-β-環(huán)糊精，電遷移進樣7.5 kV×10s，柱溫25℃，紫外波長為200 nm。采用96孔板液液萃取對300μL血漿進行樣品前處理