運(yùn)動(dòng)和黃芪丹參對(duì)大鼠骨骼肌線粒體生物發(fā)生的作用.pdf

1、線粒體是真核細(xì)胞內(nèi)的能量轉(zhuǎn)換器，不僅通過(guò)氧化磷酸化生成ATP、在細(xì)胞能量供給中起決定性作用，還在生長(zhǎng)發(fā)育、凋亡、衰老過(guò)程中起重要作用。線粒體的生物發(fā)生主要指在一個(gè)細(xì)胞的生命周期中線粒體的增殖、系統(tǒng)發(fā)生和個(gè)體發(fā)生過(guò)程。線粒體DNA(mtDNA)位于線粒體基質(zhì)，是由16569bp組成的雙鏈、閉環(huán)結(jié)構(gòu)，含37個(gè)基因，編碼13條多肽鏈，22種tRNA和2種rRNA，但這些只能編碼線粒體產(chǎn)生與合成所需蛋白總量的一小部分，其余蛋白仍需核基因組編碼。

2、因此，線粒體生物發(fā)生需要核與線粒體基因組的共同表達(dá)。目前有大量研究表明運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)線粒體生物發(fā)生，但其分子機(jī)制仍不完全清楚。以H<,2>O<,2>為主的ROS作為第二信使可以調(diào)節(jié)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和多種因子的作用，因此研究運(yùn)動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生的適量ROS是否作為第二信使誘導(dǎo)線粒體生物發(fā)生，是否是骨骼肌耐力運(yùn)動(dòng)適應(yīng)、運(yùn)動(dòng)能力提高、骨骼肌線粒體增殖的生化基礎(chǔ)；以及這一基礎(chǔ)是否是臨床應(yīng)用黃芪丹參治療骨骼肌損傷和促疲勞恢復(fù)的治療機(jī)制都有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

3、 本研究的目的在于： (1)探討一次急性運(yùn)動(dòng)及耐力運(yùn)動(dòng)后線粒體生物發(fā)生相關(guān)因子的時(shí)相性變化，線粒體形態(tài)及酶學(xué)變化，以及在運(yùn)動(dòng)誘發(fā)線粒體生物發(fā)生過(guò)程中對(duì)PKB/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響情況。 (2)探討過(guò)氧化氫對(duì)原代培養(yǎng)骨骼肌細(xì)胞存活狀態(tài)的影響，探索過(guò)氧化氫在不同劑量及作用時(shí)間對(duì)線粒體生物發(fā)生相關(guān)因子的影響，確定其體外最適作用劑量和體外最適作用時(shí)間(可激發(fā)線粒體生物發(fā)生，又不至引發(fā)細(xì)胞死亡)，從而了解以過(guò)氧化氫為主的R0s對(duì)線粒體生

4、物發(fā)生相關(guān)因子的作用機(jī)制。(3)探討黃芪丹參和/或游泳耐力訓(xùn)練在誘導(dǎo)線粒體生物發(fā)生過(guò)程中的作用，研究黃芪丹參促進(jìn)骨骼肌損傷修復(fù)、抗疲勞的分子生物學(xué)機(jī)制。本研究共分三個(gè)部分，研究方法及結(jié)論如下。 一、運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠骨骼肌線粒體生物發(fā)生機(jī)制的影響方法：1、一次急性運(yùn)動(dòng)組選用雄性SD大鼠42只，隨機(jī)分為7組：對(duì)照組(C1組)6只；運(yùn)動(dòng)即刻組(Oh組)6只；一次運(yùn)動(dòng)后3小時(shí)組(3h組)6只；一次運(yùn)動(dòng)后6小時(shí)組(6h組)6只；一次運(yùn)動(dòng)后12小

5、時(shí)組(12h組)6只；一次運(yùn)動(dòng)后18小時(shí)組(18h組)6只；一次運(yùn)動(dòng)后24小時(shí)組(24h組)6只。所有訓(xùn)練組進(jìn)行2天適應(yīng)性游泳，每天一次，每次10min以后每次游3小時(shí)，每天2次(共計(jì)6小時(shí)為一次長(zhǎng)時(shí)游泳運(yùn)動(dòng))，中間間隔45分鐘。2、耐力訓(xùn)練組選用雄性SD大鼠42只，隨機(jī)分為7組：對(duì)照組(C2組)6只；6周最后一次運(yùn)動(dòng)后即刻組(OH組)6只；6周最后一次運(yùn)動(dòng)后3小時(shí)組(3H組)6只；6N最后一次運(yùn)動(dòng)后6小時(shí)組(6H組)6只；6周最后一次

6、運(yùn)動(dòng)后12小時(shí)組(12H組)6只；6周最后一次運(yùn)動(dòng)后18小時(shí)組(18H組)6只；6周最后一次運(yùn)動(dòng)后24小時(shí)組(24H組)6只。所有訓(xùn)練組2天適應(yīng)性游泳，每天一次，每次10min；以后前4周每次游40min，每天1次；后2周每次游60min，每天1次，共游泳6周。急性及耐力運(yùn)動(dòng)結(jié)束后，分別取各大鼠腓腸肌，檢測(cè)線粒體酶復(fù)合體Ⅳ(complex Ⅳ，COX Ⅳ)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase．NOS)、超氧化物歧化

7、酶(superoxide dismutase，SOD)活性；電鏡檢測(cè)骨骼肌線粒體；采用SYBRGreen Ⅰ逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測(cè)定各組大鼠骨骼肌過(guò)氧化體增殖活化受體γ輔助活化因子1α(Peroxisome proliferator-activatedreceptor-gamma coactivator-1，PGC-1α)、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrialtranscriptional factor-A，mtTFA)

8、、線粒體轉(zhuǎn)錄因子B2(mitochondrial transcriptionalfactor-B2，mtTFB2)、核呼吸因子-1(nuclear respiratory factor，NRF-1)mRNA表達(dá)水平：Western-blotting方法檢測(cè)Phospho-Akt(Ser473)水平。 結(jié)論：1、一次急性運(yùn)動(dòng)及耐力訓(xùn)練可提高運(yùn)動(dòng)恢復(fù)期大鼠骨骼肌的PGC-1α、mtTFA、mtTFB2、NRF-1 mRNA水平，這可

9、能是運(yùn)動(dòng)通過(guò)增強(qiáng)AKt磷酸化水平，刺激PKB/AKt通路級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，提高骨骼肌抗缺氧水平，從而促進(jìn)線粒體生物發(fā)生。2、PKB/AKt途徑也可以通過(guò)提高NOS活性，增加NO生成量，并使其在生理水平范圍內(nèi)達(dá)到較高水平，促進(jìn)線粒體呼吸功能。3、運(yùn)動(dòng)后骨骼肌PGC-1α與mtTFA mRNA表達(dá)的時(shí)相性變化是由多因素制約的，這有待進(jìn)一步的研究揭示。4、運(yùn)動(dòng)誘發(fā)線粒體生物發(fā)生的PGC-1 α/mtTFA旁路是否還伴隨Akt旁路以外其他旁路的調(diào)節(jié)

10、作用還有待進(jìn)一步研究。5、耐力運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)PGC-1 α可能同線粒體生物發(fā)生的早期事件無(wú)關(guān)。 二、過(guò)氧化氫對(duì)骨骼肌原代培養(yǎng)細(xì)胞線粒體生物發(fā)生的影響機(jī)制方法：本研究中提取新生24h內(nèi)乳鼠骨骼肌細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，并用過(guò)氧化氫作為外源性ROS誘因刺激細(xì)胞，嘗試激發(fā)線粒體生物發(fā)生。原代培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞分四部分處理：①一部分種植于96孔板的細(xì)胞，分別用不同濃度的H<,2>O<,2>進(jìn)行作用，濃度分別為：0 μ M，25 μ M，50 μ

11、M，100 μ M，200 μ M，400 μ M，在作用后的1h、3h、6h、18h進(jìn)行MTT檢測(cè)；②加入100 μ M H<,2>O<,2>，分別在1h、3h、6h、18h收集細(xì)胞，并設(shè)空白對(duì)照組，進(jìn)行RNA提取和檢測(cè)；⑧100 μ M H<,2>O<,2>處理的細(xì)胞離心洗滌收集后，加入戊二醛進(jìn)行電鏡檢測(cè)；④提取線粒體，進(jìn)行酶活性檢測(cè)。 結(jié)果：0-400μM H<,2>O<,2>作用骨骼肌細(xì)胞1h后MTT值顯示，100μM和

12、200μM劑量H<,2>O<,2>作用后的細(xì)胞MTT值較空白對(duì)照組明顯增加，選擇100μM作為最佳濃度劑量，分別在刺激1h、3h、6h、18h進(jìn)行MTT值測(cè)定： MTT值只在1h后明顯增加，而其它時(shí)間點(diǎn)則明顯低于空白對(duì)照組；COXⅣ在1h和3h后活性提高；NOS活性的變化同COX Ⅳ活性的變化趨勢(shì)。電鏡下可見(jiàn)空白對(duì)照組有大量的線粒體，線粒體嵴緊密且整齊，線粒體邊緣整齊；100 μM H<,2>O<,2>作用1h組線粒體在胞核周?chē)罅慷逊e

13、，排列紊亂，多數(shù)線粒體腫脹呈球形；3h和6h組線粒體嵴發(fā)生不同程度的斷裂或消失，甚至外膜破裂；18h組大部分線粒體基質(zhì)如絮狀，基質(zhì)變淡，基質(zhì)顆?；鞠В张菝黠@增多，有的線粒體數(shù)個(gè)空泡彼此融合，形成一個(gè)大空泡，線粒體數(shù)目減少。熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明PGC-1α mRNA水平只在100gM H<,2>O<,2>作用3h后較空白對(duì)照組明顯增加；mtTFA mRNA水平在作用1h、3h、6h后均較空白對(duì)照組有明顯增加，在18h后又下降；

14、mtTFB2 mRNA水平則在3h，6h，18h后均較空白對(duì)照組有明顯增加；NRF-1 mRNA水平只在作用1h后較空白對(duì)照組有明顯增加，其它各時(shí)間點(diǎn)都沒(méi)有改變。 全文總結(jié)：1、一次長(zhǎng)時(shí)和耐力游泳運(yùn)動(dòng)都可以影響線粒體生物發(fā)生，線粒體生物發(fā)生的相關(guān)因子和酶活性呈現(xiàn)時(shí)相性變化。2、過(guò)氧化氫作為第二信使介導(dǎo)了線粒體的生物發(fā)生，且其作用濃度和作用時(shí)間是影響線粒體功能的主要因素。3、黃芪丹參也可以影響線粒體生物發(fā)生，這一作用可以通過(guò)對(duì)