腺苷酸環(huán)化酶Ⅲ(AC3)在非神經(jīng)細胞中定位的研究.pdf

1、cAMP作為細胞內(nèi)最重要的第二信使之一,調(diào)節(jié)細胞的許多生物學功能,包括卵子發(fā)生、胚胎發(fā)育、幼體發(fā)育、荷爾蒙分泌、糖代謝、平滑肌收縮、心臟收縮、嗅覺、學習以及記憶等。
　　腺苷酸環(huán)化酶(AC)是cAMP信號轉(zhuǎn)導通路的重要組分,其主要作用是催化ATP生成cAMP。AC3是AC家族中的第3個成員,它是已分離、鑒定的其中9個膜整合蛋白之一。研究發(fā)現(xiàn)AC3不僅表達于小鼠海馬區(qū)、下丘腦和嗅覺表皮組織等部位的神經(jīng)細胞纖毛,還廣泛存在于脊髓、腎上

2、腺髓質(zhì)和皮質(zhì)、心房肌、主動脈平滑肌、肺、腎、胰島、睪丸和卵巢等多種組織器官,并與多種生理功能密切相關(guān)。
　　纖毛是突出于真核細胞表面的、以微管為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的“毛發(fā)狀”細胞器,它能感知細胞外機械和化學信號刺激。纖毛分為兩大類:運動纖毛和不動纖毛,不動纖毛即初級纖毛,它普遍存在于多種生物的各種類型細胞表面。初級纖毛上含有多種特異受體、離子通道蛋白和信號轉(zhuǎn)導蛋白等。近年發(fā)現(xiàn)初級纖毛參與了細胞內(nèi)信號傳導等多種細胞生物學過程,對動物的發(fā)育調(diào)控

3、及維持各個組織器官正常生理功能具有重要作用。
　　盡管AC3表達在多種非神經(jīng)細胞中并具有重要的生理功能,但它在這些非神經(jīng)細胞的表達部位,尚待確定。本研究旨在明確AC3在這些非神經(jīng)細胞中的表達情況以及表達部位。
　　本論文以大鼠嗜鉻細胞瘤PC12、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U251、小鼠腎內(nèi)髓集合管上皮細胞IMCD3、人腎上皮細胞293T、骨髓基質(zhì)干細胞BMSCs、成骨細胞OB、人宮頸癌細胞HeLa和人肺癌細胞A549為研究材料。研究的

4、內(nèi)容主要分為2個部分:
　　第一部分通過RT-PCR技術(shù)對細胞的AC3基因mRNA表達水平進行半定量,PCR產(chǎn)物DNA測序,所得序列用生物學軟件DNAMAN6.0分別將人和鼠的AC3基因 cDNA進行比對分析。
　　第二部分:運用細胞免疫熒光染色,對PC12、U251、IMCD3、293T、OB和BMSC以及A549和HeLa細胞中AC3的表達部位進行確定。
　　研究結(jié)果如下:
　　1、以AC3基因的特異性引物,

5、擴增并檢測AC3基因在相關(guān)細胞中有擴增產(chǎn)物,對PCR產(chǎn)物測序并進行比對分析顯示,這些細胞中均有AC3基因的內(nèi)源性表達。
　　2、免疫熒光染色結(jié)果顯示PC12和U251細胞株中均發(fā)現(xiàn)了陽性標記的AC3抗體,并與纖毛標記抗體Acetylatedα-Tubulin染色發(fā)生重疊。小鼠IMCD3細胞株和人腎組織的293T細胞中大多細胞具有初級纖毛亞結(jié)構(gòu),且AC3亞定位于該細胞的纖毛部位,在這兩種腎細胞中,AC3表達于初級纖毛。BMSC細胞中

6、能直觀地觀察到AC3亞定位于初級纖毛上。在A549細胞中AC3陽性結(jié)果與初級纖毛標記物Acetylatedα-Tubulin陽性結(jié)果完全重合,且AC3沿著初級纖毛軸絲分布;在 HeLa細胞中初級纖毛與AC3的分布情況類似于A549細胞中的結(jié)果。雖然OB細胞中也有陽性AC3呈顆粒狀紅色熒光,但AC3與初級纖毛并不存在共定位關(guān)系。
　　結(jié)論:
　　1、AC3基因內(nèi)源性表達于PC12、U251、IMCD3、293T、BMSCs、O