百日咳腺苷酸環(huán)化酶毒素基因的克隆、原核表達(dá)、純化及初步鑒定.pdf

1、目的:通過對(duì)百日咳桿菌腺苷酸環(huán)化酶毒素基因(cyaA)及cyaC基因進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a/cyaA、pET30a/cyaC并轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5α中，經(jīng)篩選保存陽性克隆菌。進(jìn)一步構(gòu)建雙基因重組質(zhì)粒pET30a/cyaCA。重組質(zhì)粒pET30a/cyaA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，并使重組百日咳桿菌腺苷酸環(huán)化酶毒素基因cyaA在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)。對(duì)表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行初步的純化，得到純度達(dá)90[％]左右的

2、重組蛋白，并對(duì)重組蛋白進(jìn)行初步的鑒定。這些為對(duì)重組百日咳桿菌腺苷酸環(huán)化酶毒素(CyaA，ACT)作進(jìn)一步的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:用試劑盒提取百日咳鮑特菌CS株的總DNA；根據(jù)GenBank收錄的百日咳鮑特菌腺苷酸環(huán)化酶毒素基因cyaA、cyaC基因序列，設(shè)計(jì)引物并送生物公司合成；以所提取的總DNA為模板，PCR擴(kuò)增出cyaA、cyaC基因。對(duì)擴(kuò)增片段和質(zhì)粒進(jìn)行酶切后連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布于卡那平板，3

3、7℃培養(yǎng)過夜，挑取若干菌落少量培養(yǎng)，經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定及提取質(zhì)粒后進(jìn)行質(zhì)粒酶切鑒定，陽性克隆產(chǎn)物送生物公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果應(yīng)用DNAStar軟件進(jìn)行序列拼接與分析。所得序列在NCBI中進(jìn)行Blast分析。把以pET30a/cyaA為模板PCR擴(kuò)增出的，帶有質(zhì)粒T7啟動(dòng)子的cyaA全片段連接于質(zhì)粒pET30a/cyaC上，同上方法構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET30a/cyaCA。
　　 提取陽性克隆菌質(zhì)粒pET30a/cyaA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL

4、21(DE3)，涂布于卡那平板，37℃培養(yǎng)過夜，挑取若干菌落少量培養(yǎng)，PCR擴(kuò)增鑒定及提取質(zhì)粒后對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。對(duì)陽性轉(zhuǎn)化菌進(jìn)行少量培養(yǎng)，并用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-凝膠電泳檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況。對(duì)陽性轉(zhuǎn)化菌進(jìn)行大量培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后對(duì)其進(jìn)行純化前處理：超聲破碎菌體、超聲不溶物溶解、SDS-凝膠電泳檢測(cè)目的蛋白表達(dá)形式。用透析液透析待純化液體，上DEAE陰離子交換柱純化蛋白，先用A液(2M urea，20mM Tris，p

5、H 8.0)洗柱至A280達(dá)基線水平，再用9[％]B液(2M urea，2M NaCl，20mM Tris，pH 8.0)洗脫雜蛋白，最后用40[％]B液洗脫目的蛋白，收集洗脫峰。SDS-凝膠電泳檢測(cè)洗脫峰含目的蛋白情況，濃縮純化的重組蛋白并分析其純度。
　　 用全細(xì)胞百白破疫苗(wPV)、無細(xì)胞百白破疫苗(aPV)及生理鹽水免疫NIH小鼠，心臟采血后獲得血清。以純化的重組百日咳CyaA包被96孔板，免疫后小鼠血清作為一抗，采用

6、間接ELISA法檢測(cè)重組百日咳CyaA的反應(yīng)原性。此外，重組百日咳CyaA經(jīng)SDS-凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，以免疫后小鼠血清作為一抗進(jìn)行Western Blot(WB)檢測(cè)，進(jìn)一步檢測(cè)重組百日咳CyaA的反應(yīng)活性。此外，用學(xué)齡前兒童wPV免疫前后血清作一抗對(duì)重組CyaA進(jìn)行ELISA和WB檢測(cè)。
　　 結(jié)果:成功克隆了百日咳腺苷酸環(huán)化酶毒素cyaA基因，其序列已向GenBank提交并被收錄，序列號(hào)為GQ370813。在原核

7、細(xì)胞中表達(dá)了重組百日咳CyaA，經(jīng)初步純化，重組蛋白的純度達(dá)90[％]左右，濃縮后蛋白濃度為0.83mg/ml。經(jīng)ELISA檢測(cè)，全細(xì)胞百白破疫苗免疫組血清的抗體濃度水平明顯高于無細(xì)胞百白破疫苗和生理鹽水免疫組(p<0.05)，而無細(xì)胞百白破疫苗免疫組血清抗體濃度水平與生理鹽水免疫組的無明顯差異(p>0.05)。Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明，全細(xì)胞百白破疫苗免疫血清組在預(yù)期的位置有明顯的顯色條帶，無細(xì)胞百白破疫苗免疫血清組在預(yù)期