百日咳腺苷酸環(huán)化酶毒素基因的克隆、原核表達、純化及初步鑒定.pdf

1、目的:通過對百日咳桿菌腺苷酸環(huán)化酶毒素基因(cyaA)及cyaC基因進行擴增，構建重組質粒pET30a/cyaA、pET30a/cyaC并轉化進入大腸桿菌DH5α中，經(jīng)篩選保存陽性克隆菌。進一步構建雙基因重組質粒pET30a/cyaCA。重組質粒pET30a/cyaA轉化大腸桿菌BL21(DE3)，并使重組百日咳桿菌腺苷酸環(huán)化酶毒素基因cyaA在大腸桿菌BL21(DE3)中表達。對表達的目的蛋白進行初步的純化，得到純度達90[％]左右的

2、重組蛋白，并對重組蛋白進行初步的鑒定。這些為對重組百日咳桿菌腺苷酸環(huán)化酶毒素(CyaA，ACT)作進一步的應用研究奠定基礎。
　　 方法:用試劑盒提取百日咳鮑特菌CS株的總DNA；根據(jù)GenBank收錄的百日咳鮑特菌腺苷酸環(huán)化酶毒素基因cyaA、cyaC基因序列，設計引物并送生物公司合成；以所提取的總DNA為模板，PCR擴增出cyaA、cyaC基因。對擴增片段和質粒進行酶切后連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5α，涂布于卡那平板，3

3、7℃培養(yǎng)過夜，挑取若干菌落少量培養(yǎng)，經(jīng)PCR擴增鑒定及提取質粒后進行質粒酶切鑒定，陽性克隆產物送生物公司測序。測序結果應用DNAStar軟件進行序列拼接與分析。所得序列在NCBI中進行Blast分析。把以pET30a/cyaA為模板PCR擴增出的，帶有質粒T7啟動子的cyaA全片段連接于質粒pET30a/cyaC上，同上方法構建了重組質粒pET30a/cyaCA。
　　 提取陽性克隆菌質粒pET30a/cyaA，轉化大腸桿菌BL

4、21(DE3)，涂布于卡那平板，37℃培養(yǎng)過夜，挑取若干菌落少量培養(yǎng)，PCR擴增鑒定及提取質粒后對該質粒進行酶切鑒定。對陽性轉化菌進行少量培養(yǎng)，并用IPTG誘導表達，SDS-凝膠電泳檢測目的蛋白表達情況。對陽性轉化菌進行大量培養(yǎng)，IPTG誘導表達后對其進行純化前處理：超聲破碎菌體、超聲不溶物溶解、SDS-凝膠電泳檢測目的蛋白表達形式。用透析液透析待純化液體，上DEAE陰離子交換柱純化蛋白，先用A液(2M urea，20mM Tris，p

5、H 8.0)洗柱至A280達基線水平，再用9[％]B液(2M urea，2M NaCl，20mM Tris，pH 8.0)洗脫雜蛋白，最后用40[％]B液洗脫目的蛋白，收集洗脫峰。SDS-凝膠電泳檢測洗脫峰含目的蛋白情況，濃縮純化的重組蛋白并分析其純度。
　　 用全細胞百白破疫苗(wPV)、無細胞百白破疫苗(aPV)及生理鹽水免疫NIH小鼠，心臟采血后獲得血清。以純化的重組百日咳CyaA包被96孔板，免疫后小鼠血清作為一抗，采用

6、間接ELISA法檢測重組百日咳CyaA的反應原性。此外，重組百日咳CyaA經(jīng)SDS-凝膠電泳后轉移至硝酸纖維素膜，以免疫后小鼠血清作為一抗進行Western Blot(WB)檢測，進一步檢測重組百日咳CyaA的反應活性。此外，用學齡前兒童wPV免疫前后血清作一抗對重組CyaA進行ELISA和WB檢測。
　　 結果:成功克隆了百日咳腺苷酸環(huán)化酶毒素cyaA基因，其序列已向GenBank提交并被收錄，序列號為GQ370813。在原核

7、細胞中表達了重組百日咳CyaA，經(jīng)初步純化，重組蛋白的純度達90[％]左右，濃縮后蛋白濃度為0.83mg/ml。經(jīng)ELISA檢測，全細胞百白破疫苗免疫組血清的抗體濃度水平明顯高于無細胞百白破疫苗和生理鹽水免疫組(p<0.05)，而無細胞百白破疫苗免疫組血清抗體濃度水平與生理鹽水免疫組的無明顯差異(p>0.05)。Western Blot檢測結果表明，全細胞百白破疫苗免疫血清組在預期的位置有明顯的顯色條帶，無細胞百白破疫苗免疫血清組在預期