人類SPATA12基因在UV-C誘導(dǎo)DNA損傷修復(fù)中的作用研究.pdf

1、基因組DNA的遺傳穩(wěn)定性是維持正常的細(xì)胞復(fù)制、增殖和分化的關(guān)鍵。外源因素和內(nèi)源因素造成的DNA損傷及其修復(fù)失敗，是各種遺傳疾病發(fā)生的根本原因。其中，內(nèi)源因素包括DNA復(fù)制錯(cuò)誤、細(xì)胞代謝活動(dòng)產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)（如自由基）。外源因素包括紫外線、放射線、藥物和病毒等。目前認(rèn)為，DNA損傷應(yīng)答與修復(fù)是一個(gè)涉及多種相關(guān)基因精細(xì)調(diào)節(jié)的復(fù)雜過(guò)程，研究這些相關(guān)基因在此過(guò)程中的機(jī)制和特性，對(duì)于闡明DNA損傷與疾病發(fā)生的關(guān)系具有重要意義。
　　 SPA

2、TA12基因(Spermatogenesis Associated Gene12，SPATA12)是一個(gè)精子發(fā)生相關(guān)基因，主要定位于初級(jí)精母細(xì)胞和精子細(xì)胞中。在人類染色體上，SPA TA12定位于一個(gè)重要的抑癌基因侯選區(qū)域3p14。我們前期的研究工作發(fā)現(xiàn)，SPATA12可能作為抑制因子在精子發(fā)生或腫瘤發(fā)生中起作用。通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)，我們課題組篩選到一個(gè)與SPATA12相互作用的蛋白CHD2。已知CHD2是一個(gè)染色質(zhì)重塑因子，可以通過(guò)影

3、響p53的轉(zhuǎn)錄活性來(lái)參與DNA損傷應(yīng)答途徑的后期階段反應(yīng)?；谝陨涎芯勘尘埃菊撐闹饕接懥薙PATA12與CHD2的關(guān)系以及SPA TA12在DNA損傷中的作用及其機(jī)制。研究工作主要包括以下三個(gè)方面:
　　 1.SPATA12與CHD2相互作用的確定
　　 通過(guò)分別構(gòu)建SPATA12-EGFP融合熒光蛋白和CHD2-DsRed融合熒光蛋白，利用基因轉(zhuǎn)染和激光共聚焦技術(shù)，共定位實(shí)驗(yàn)顯示CHD2與SPATA12共同定位于細(xì)

4、胞核，在空間上具備相互作用的基礎(chǔ);通過(guò)雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)證實(shí)了二者在核內(nèi)相互結(jié)合的真實(shí)性。
　　 2.紫外UV-C誘導(dǎo)的細(xì)胞DNA損傷模型的建立
　　 通過(guò)MTT、PI雙染、流式細(xì)胞術(shù)以及單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)，分別從細(xì)胞行為與功能、DNA結(jié)構(gòu)完整性等方面進(jìn)行綜合分析，成功建立了一個(gè)合適的紫外(UV-C)誘導(dǎo)的DNA損傷模型。
　　 3.SPATA12應(yīng)答DNA損傷反應(yīng)的作用及機(jī)制
　　 通過(guò)RT-PCR和W

5、estern bloting實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，在Hela和MCF-7細(xì)胞中，SPATA12能夠被UV-C誘導(dǎo)而重新表達(dá)。通過(guò)克隆形成、細(xì)胞劃痕和宿主活細(xì)胞再活化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在UV-C誘導(dǎo)的DNA損傷中，外源表達(dá)的SPATA12能夠抑制細(xì)胞增殖和克隆形成率。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)和AP-1 decoy ODNs技術(shù)，從正反兩個(gè)方面證實(shí)了SPATA12可通過(guò)其啟動(dòng)子區(qū)域的AP-1結(jié)合位點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)UV-C損傷的應(yīng)答。進(jìn)而，我們將SPATA1

6、2基因分別轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞(p53null)、Hela細(xì)胞(p53 functional deletion)和MCF-7細(xì)胞(p53 WT)中，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，結(jié)果提示SPA TA12在應(yīng)答UV-C誘導(dǎo)DNA損傷的過(guò)程中，其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用可能是p53依賴性的。更重要的是，我們發(fā)現(xiàn)外源表達(dá)SPATA12能夠促進(jìn)p53的表達(dá)，顯示SPATA12可能通過(guò)促進(jìn)p53的表達(dá)來(lái)阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程。
　　 綜上，我們證實(shí)了SPATA