PIF1解螺旋酶在DNA損傷修復(fù)中的作用.pdf

1、目的：利用PIF1敲低細(xì)胞系，研究PIF1蛋白與細(xì)胞周期及輻射應(yīng)答之間的關(guān)系；構(gòu)建人PIF1及其C末端解螺旋酶模序（PIF1C）和N末端PINT結(jié)構(gòu)域（PIF1N）截短體真核表達(dá)重組質(zhì)粒，進(jìn)行真核表達(dá)，并確定PIF1、PIF1C、PIF1N在細(xì)胞內(nèi)定位；設(shè)計(jì)能抑制PIF1的SiRNA序列，構(gòu)建SiRNA真核表達(dá)載體，鑒定為下一步實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備；DR-GFP-U2OS細(xì)胞模型雙鍵斷裂損傷后，分別敲低、過表達(dá)PIF1、及其C末端解螺旋酶模序（P

2、IF1C）和N末端PINT結(jié)構(gòu)域（PIF1N）。檢測(cè)綠熒光變化。明確PIF1在DNA雙鏈斷裂損傷中同源重組修復(fù)中的作用。
　　方法：HeLa細(xì)胞經(jīng)TDR雙阻斷后，不同時(shí)間點(diǎn)收細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期同步化時(shí)相，Western blot檢測(cè)PIF1蛋白的變化。HeLa細(xì)胞進(jìn)行60Coγ射線不同劑量照射，按時(shí)間點(diǎn)收細(xì)胞，Western blot檢測(cè)PIF1蛋白的變化水平；PIF1敲低細(xì)胞系及對(duì)照組細(xì)胞經(jīng)TDR雙阻斷后，分別在不同時(shí)

3、間點(diǎn)收細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)周期各時(shí)相細(xì)胞所占比例。PIF1敲低細(xì)胞系及對(duì)照組細(xì)胞分別進(jìn)行4、20Gy照射，照射后分別在0、24h、48h收細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；以HeLa cDNA為模板 PCR獲取PIF1、PIF1C、PIF1N編碼區(qū)cDNA,將其插入pCMV-Tag2B質(zhì)粒中構(gòu)建PIF1、PIF1C、PIF1N真核表達(dá)重組質(zhì)粒；通過lipofectamine2000將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人293細(xì)胞中，Western blot方

4、法檢測(cè)其在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，用免疫熒光的方法檢測(cè)其細(xì)胞內(nèi)定位；將設(shè)計(jì)好的抑制PIF1的SiRNA序列送公司合成后，Western blot檢測(cè)，確定敲低序列；將低敲的PIF1siRNA、過表達(dá)的PIF1、PIF1C、PIF1N真核表達(dá)重組質(zhì)粒通過lipofectamine2000分別轉(zhuǎn)入DR GFP U2OS細(xì)胞中，24h后再分別轉(zhuǎn)入I-SceI的表達(dá)質(zhì)粒，48h后檢測(cè)綠熒光蛋白的強(qiáng)度變化。
　　結(jié)果：雙阻斷后，PIF1蛋白的含量

5、在S期顯著升高。進(jìn)行60Coγ射線照射后，各劑量PIF1蛋白均有先下降后升高的趨勢(shì)，2Gy在2h左右蛋白含量下降，4h左右開始升高，4Gy在2h左右蛋白含量下降，6h左右開始升高，10Gy在2h左右蛋白含量下降，10h左右開始升高；敲低細(xì)胞系在G2/M期的含量明顯高于對(duì)照組，照射后，敲低組細(xì)胞凋亡率48h內(nèi)明顯升高；成功構(gòu)建PIF1及其截短體真核表達(dá)重組體，并在真核細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)。確定 PIF1定位于整個(gè)細(xì)胞，呈彌散狀分布，PIF1解螺

6、旋酶模序主要定位于胞漿中，PIF1 PINT結(jié)構(gòu)域主要定位于核周；成功構(gòu)建了抑制 PIF1的SiRNA，并在真核細(xì)胞中成功表達(dá)；敲低組PIF1的綠熒光強(qiáng)度低于對(duì)照組，敲低又過表達(dá)PIF1的綠熒光強(qiáng)度較敲低組略有升高，PIF1、PIF1C、PIF1N的綠熒光強(qiáng)度高于對(duì)照組，但 PIF1、PIF1N的熒光強(qiáng)度相近且高于PIF1C。
　　結(jié)論：1.PIF1在細(xì)胞周期S期表達(dá)量升高，可能與細(xì)胞的復(fù)制有關(guān)。2.PIF1影響細(xì)胞周期的G2/M